В условиях in vitro. Ключевой этап размножения растений IN VITRO

На правах рукописи

ХАПОВА Светлана Александровна

УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO И ПОСЛЕДУЮЩАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ РАСТЕНИЙ ЗЕМЛЯНИКИ

Специальность 06.01.07 - плодоводство

Москва 1997

Работа выполнена во Всероссийском селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства.

Научный руководитель - кандидат сельскохозяйственных наук В.А.Высоцкий.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук Ф.Я.Поликарпова; кандидат сельскохозяйственных наук Т.А.Никиточкина.

Ведущее предприятие - Главный ботанический сад Российской академии наук им. М.Н.Цицина.

Защита состоится.. . ............ 1992 г.

в......... часов на заседании диссертационного совета Д

020.20.01 во Всероссийском селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства по адресу: 115598, Москва, ул.Заг^б^ш, 4, ВСТИСП. Учёный совет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского селекционно-технологического института садоводства и питомниководства.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат сельскохозяйственных наук

Л.А.ПРИНЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В нашей стране земляника является самой популярной ягодной культурой. Её ценят за ранние сроки созревания.

Постоянный и высокий спрос населения на свежие ягоды земляники и продукты их переработки обуславливается их высокими вкусовыми качествами. Ягоды земляники имеют прекрасный вкус, нежную консистенцию мякоти и приятный аромат, сбалансированное сочетание Сахаров и кислот, - это делает их десертным продуктом.

В восьмидесятых годах площадь под земляникой составляла 24 тыс. га с тенденцией увеличения удельного веса этой культуры до 40% от площадей, занимаемых всеми ягодными. В Московской области земляника занимает 45% площади промышленных посадок ягодников.

В настоящее время культура земляники в Нечерноземье, как и в целом в России, требует серьёзного внимания ввиду резкого сокращения плодоносящих площадей после подмерзания растений в суровые зимы, распространения рада опасных грибных и вирусных болезней. Закладка новых насаждений земляники сдерживается отсутствием в достаточном количестве оздоровленного посадочного материала перспективных сортов. В частности, биотехнические методы широко используются в практике плодоводства для получения и ускоренного размножения оздоровленного посадочного материала земляники.

Несколько лет назад были сделаны наблюдения, показывающие, что растения, регенерировавшие из соматических клеток в культуре тканей, не являются однородными, а проявляют значительную генетическую вариабельность. Эта вариабельность обозначается термином "сомаклональная изменчивость". Возникает вопрос, является ли сомаклональная изменчивость результатом реализации генетических различий уже существующих в соматических клетках изменений или это нарушается компонентами питательной среды.

Изменяя состав питательной среды, на которой культивируются различные виды растений, можно изменить их физиологическое состояние, усиливать и замедлять их рост, фотосинтез, повышать устойчивость к неблагоприятным воздействиям.

Для каждого вида и даже сорта культурного растения состав питательной среды необходимо подбирать индивидуально. Кроме того, для обеспечения активного роста нужна одна среда, для размножения - другая, для сохранения растений - третья, для ускорения - четвёртая. Следовательно, для каждого растения в агделыюсги, с учётом целей, необходимо разрабатывать особый состав питательной среды, соблюдая определённый баланс составляющих её компонентов. Данный факт свидетельствует о важности и необходимости расширения исследовательских работ по изучению условий влияния питательной среды in vitro на поведение растений регенератов земляники.

Выращивание растений в условиях in vitro даёт возможность контролировать многие факторы внешней среды: температуру, влажность, продолжительность и интенсивность светового дня.

Одним из главных направлений повышения продуктивности и устойчивости растениеводства и садоводства на современном этапе, является применение интенсивных технологий возделывания. В большинстве случаев в качестве обязательного приёма для борьбы с сорняками такие технологии включают применение гербицидов нового поколения, которые должны обладать высокой эффективностью и, в то же время, быть безвредными для человека и окружающей среды.

Система производства растений земляники с применением метода in vitro приобретает большую актуальность, поскольку ценность посадочного материала неизмеримо выше, чем рядовых растений.

Пели и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлось изучение влияния условий культивирования на способность

земляники разных групп (обычные, ремонтантные, нейтрально-дневные) к размножению in vitro и последующую продуктивность растений.

Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить влияние продолжительности освещения на этапах микроразмножения на биометрические показатели.

2. Определить степень влияния разного состава питательных сред на коэффициент размножения эксплантов земляники.

3. Определить пороговые концентрации вводимых в среду гербицидов для последующего отбора сомаклональных вариантов и трансформантов по признаку гербицидоустойчивосги.

4. Изучить влияние сроков переноса пробирочных растений в нестерильные условия на приживаемость.

5. Провести сравнительную оценку развития земляники, полученной методом

in vitro с растениями, выращенными обычными методами, в полевых условиях.

Научная новизна результатов исследований. Выявлено существенное влияние периода освещения на число побегов и их длину, количество листьев, а так же на число и длину корней, развивающихся у эксплантов испытанных сортов земляники in vitro.

Изучено влияние элементов азотного питания на развитие эксплантов земляники на этапах пролиферации при размножении. Экспериментально показана возможность совместного применения 6-бензил-аминопурина и кинетина для стимуляции бокового ветвления у эксплантов земляники. "

Впервые в культуре ткани земляники изучено влияние гербицидов на биометрические показатели и пигментную систему развивающихся эксплантов.

Определены наиболее благоприятные сроки для высадки пробирочных растений земляники в почвенные субстраты в условиях зимних отапливаемых теплиц.

Практическая ценность работы. Полученные результаты позволяют оптимизировать процесс клонального микроразмножения земляники, снизить затраты труда и себестоимость продукции по сравнению с общепринятой технологией.

Использование оптимальных сроков переноса растений в нестерильные условия дает возможность повысить выход адаптированных растений на 20% и более. Выявленные селективные концентрации гербицидов могут быть использованы для создания гербицидоустойчивых форм и получения трансгенных растений.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Всероссийском совещании "Молодые учёные -садоводству России" (г.Москва, 1995); на IV Международной конференции "Проблемы дендрологии, цветоводства, плодоводства, виноградарства и виноделия" (г-Ялта, 1996); на "The 18-th International group training on plant protection services" (Thailand, Bangkok, 1996); на IV Международной научно-практической конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье" (г.Симферополь, 1997); на VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (г.Москва, 1997); на заседаниях секций ягодных культур Учёного совета ВСТИСП (1994-1997).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано семь научных статей.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх глав, выводов и рекомендаций, списка литературы. Текст диссертации изложен на 133 листах машинописного текста, содержит 26 таблиц, 20

рисунков. Список используемой литературы в:<лючает 237 наименований, в том числе 120 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Место исследований. Эксперименты проводились в лаборатории биологического факультета Ярославского Государственного университета им. ДемидоваП.Г. Исходный материал для опытов был получен по стандартной методике клонального микроразмножения в лаборатории биотехнологии отдела размножения плодовых и ягодных культур ВСТИСП.

Объекты исследований. Объектами исследования были сорта земляники: Гора Эверест, Дукат, Женева, Зенга-Зенгана, Профъюжен, Рапелла, Редгонтлит, Трибьют, Тристар, Холидей.

Условия культивирования. Сосуды с эксплантами закрывали фольгой и термоусадочной плёнкой и культивировали при освещении 3 тыс. ж, температуре 24-26°С и относительной влажности в помещении 70-75%. Источники освещения: в светохомнаге лампы типа ЛДЦ-20, в теплице -лампы накаливания мощностью 200, 500 Вт. Освещённость в теплице составляла утром и во второй половине дня по 2,5 тыс. лк, в середине дня 4-5 тыс. лк.

В специальных экспериментах, при изучении влияния светового периода на растения регенераты, культивирование вели при 8-ми, 12-ти, 16-ти, 24-ёх - часовом световом дне.

Влияние минерального и гормонального состава питательных сред на последующую продуктивность микроразмноженных растений изучалось при фотопериоде - 16 часов световой день и 1=25°С. Интенсивность освещения 2500 лк.

Посадку, пересадку, деление конгломератов на отдельные побеги проводили в стерильных условиях ламинар-бокса КГО-1 по общепринятым методам.

Состояние эксплантов оценивали по специально разработанной пятибальной шкале.

Гербицвды вводили в питательную среду перед автоклавированием в следующих концентрациях, выбранных на основании результатов предварительных экспериментов: 2Ч0*М, 10"5М, 2*10"5М, КИМ, 2*1(НМ, 10-ЗМ.

а) симазин, ингибирующий фотосинтетический транспорт электронов, тормозящий выделение кислорода при фотосинтезе;

б) раувдап, ингубирующий синтез ароматических аминокислот.

В качестве контроля использовали питательную среду, не содержащую гербицидов.

Высадку пробирочных растений земляники в нестерильные условия проводили в два этапа:

1, Сначала укоренённые пробирочные растения пересаживали в перлит, а для поддержания высокой влажности накрывали стеклянными сосудами. Постепенно открывали стеклянные сосуды.

2. Затем, примерно через месяц, такие растения земляники пересаживали в автоклавированную почвенную смесь, которая состояла из почвы, торфа и песка в отношении 1:1:1 и переносили в условия отапливаемой теплицы.

В мае каждого года растения переносили в открытый грунт. Растения высаживали в почву, покрытую мульчирующим материалом марки СУФМК-60 чёрного цвета.

Учёты и наблюдения. В ходе экспериментов in vitro учитывали следующие показатели:

1) коэффициент размножения;

2) регенерация вегетативных органов (листьев, почек, побегов, корней) с учётом их числа на зкспланте и числа эксплантов, проявивших морфогенетические реакции;

3) укореняемость почек (или побегов).

У растений-регенерантов в полевых условиях проводили снятие следующих показателей:

1) количество усов;

2) число и площадь листьев, число рожков, цветоносов, цветков,

3) масса плодов;

4) выход укоренённых розеток;

5) изменение морфологии листьев и столонов;

6) наличие хлорофильных аномалий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

1. Реакция эксплантов земляники разных сортов на продолжительность освещения. В ходе работы мы определяли влияние режимов микроразмножения (8,12, 16 и 24 часа) на продуктивность растений разных групп сортов. Наибольшее число побегов имели экспланты, выращенные при 24-часовом периоде освещения. Среднее число побегов у сортов обычной группы (Згнга-Зенгана, Дукат, Редгонтлит) за весь период эксперимента составили 8,9 - 7,0 - 7,4 шт/эксплант, у сортов ремонтантной группы (Гора Эверест, Рапелла) - 8 - 2,9 шт/эксплант, у сортов нейтрально-дневной группы (Тристар, Трибьют) - 8,2 - 7,9 шт/экс-плант. Побегообразовательная способность у эксплантов сорта Рапелла оказалась очень низкой на всех периодах освещения (Табл. 1).

Оценка состояния растений, образуемых эксплантами разных сортов земляники в зависимости от светового режима культивирования показала, что лучше всего растения развивались при 16-часовом периоде освещения, например, состояние эксплантов, выращенных при 12-часовом периоде освещения составило 4,2 балла, при 16-часовом - 4,7 балла, а при 24-часовом - 3,6 балла.

Таблица 1

Среднее число побегов, образуемых эксплантами разных сортов земляники в зависимости от продолжительности освещения (шт.)

Сорта Продолжительность освещения

8 час/сут 12 час/сут 16 час/сут 24 час/сут

Гора Эверест 4,0 5,3 8,0 15,0

Рапелла 2,0 2,8 3,4 3,6

Дукат 4,3 5,0 7,8 11,0

Зенга-Зенгана 4,5 6,3 9,1 14,8

Редгонтлит 3,9 5,4 8,0 12,3

Тристар 5,4 6,7 8,5 14,2

Трибьют 5,6 6,8 9,2 12,1

X 4,0 5,1 7,7 Н,9

НСР05 взаимодействие 1,2

Полученные в условиях освещения продолжительностью 12 и 16 часов растения были адаптированы к нестерильным условиям.

Результаты наблюдений показали, что растения земляники, выращенные при 16-часовом периоде освещения in vitro давали существенно больше столонов, чем в случае культивирования при 12-часовом дне, а так же имели большую площадь листьев (Табл.2,3).

Действие света зависит от образования фоторецепторов и трансформации световой энергии в листовых клетках, фотостимуляции в них биосинтетических процессов.

Как показали наши исследования, более низкое количество содержания пигментов компенсируется растениями за счёт большей площади листовой поверхности.

Таблица 2

Среднее число столонов у разных сортов земляники, размноженных при различной продолжительности освещения (шт/расгение) (1995 г.)

Сорта Продолжительность освещения при микроразмножении

12час/сут 16 час/сут

Гора Эверест 33 ±3,6 40 ±2,8

Рапеяла 10 ±2,6 19 ±3,1

Зенга-Зенгана 26 ±3,1 41 ±4,2

Редгонтлит 37 ± 5,2 57 ±4,6

Дукат 14 ±3,7 24 ±3,5

Трисгар 18 +1,8 21 ±4,1

Трибыот 19 ± 1,6 25 ±4,2

Таблица 3

Влияние длины дня при культивировании in vitro на площадь листьев растений земляники в полевых условиях (1 августа 1995 г.)

Сорта Площадь листьев на 1 растении (см2)

12 час/сут 16 час/сут

Дукат 240 360

Зенга-Зенгана 550 720

Редгонтлит 450 576

Тристар 320 420

HCPos: световой режим 24,1 сорта 16,4

взаимодействие 18,2 2. Развитие эксплантов земляники в зависимости от концентрации в питательной среде разных форм азота. Как известно, процесс размножения in vitro происходит на питательных средах, из которых наибольшее распространение получила среда Мурасиге-Скуга. Однако, эта среда

содержит некоторые компоненты (особенно азот) в избыточных концентрациях.

Среди минеральных солей важное значение для роста и развития растений имеют азотосодержащие соли.

Мы исследовали влияние уменьшения состава питательной среды Мурасиге-Скуга в два и четыре раза. Наши эксперименты показали, что на этапах размножения снижать концентрацию солей в базовой среде Мурасиге-Скуга нецелесообразно. Поэтому мы попытались оценить концентрации разных форм азота в питательной среде на развитие эксплантов земляники. Оказалось, что снижение аммонийного азота в два раза не повлияло на коэффициент размножения (Табл. 4).

Таблица 4

Развитие эксплантов земляники сорта Тристар в зависимости от концентрации в питательной среде аммонийного азота

Концентрация квдо. Кол-во побегов, ТТГТ Длина побегов, ш Кол-во корней, птг Длина корней, мм Кол-во листов, тттт.

Кошроль 1650 мг/л 4,3 3,5 2,1 0,5 12,2

0,5. 4,0 3,2 0 0 14,1

0,25 3,9 3,2 0 0 12,2

0,125 3,8 3,0 0 0 11,0

0,5 4,3 3,2 0 0 12,1

0,253 3,9 3,2 0 0 12,1

0,125 3,8 3,2 0 0 10,3

НСРо5 - количество побегов

концентрация №ШОз Рф< Роз

Снижение нитратного азота в два раза отрицательно повлияло на побегообразовательную способность экспл актов. Коэффициент размножения снизился, по сравнению с контролем, на 3-4 единицы (Табл. 5).

Таблица 5

Развитие эксплантов земляники сорта Тристар в зависимости от концентрации в питательной среде нитратного азота

Концентрация Кол-во Длина

ЮТОэ побегов, побегов,

(часть) шт. см.

Контроль 1900 мг/л 5,5 2,8

НСРо5 - количество побегов

концентрация КЖ)з = 1,3

Возможно такой эффект связан с механизмом поглощения

нитратного азота. Известно, что использование кетокислот на синтез аминокислот происходит более интенсивно при наличии в питательной среде аммонийного азота; нитратный азот в меньшей степени используется на синтез аминокислот.

На основании полученных данных можно сделать заключение, что снижение концентрации аммонийного азота на 825 мг/л в среде Мурасиге-Скуга не приводит к снижению коэффициента размножения, что может быть реализовано на практике.

3. Действие иитокининов и ауксинов на развитие эксплантов земляники. Так же одним из важных компонентов питательной среды являются регуляторы роста. Тщательный подбор и выявление оптимальных концентраций позволяют повысить эффективность метода клонального размножения.

Мы изучали сочетание 6-БАП и кинетина на развитие эксплантов. Сочетания 6-БАП и кинетина в концентрациях 0,25 мг/л + 0,25 мг/л и 0,25 мг/л + 0,5 мг/л соответственно незначительно стимулировали рост почек и разворачивание листочков (Табл. 6).

Таблица 6

Зависимость коэффициента размножения от концентрации 6-БАП и кинетина в питательной среде (сорт Зенга-Зенгана)

Концешрация цигокининов, г/л Число образовавшихся побегов, шт. Длина побегов, см.

6-БАП Кинетин

Контроль 6-БАП 1 мг/л 10,0 2,5

0,25 0,25 3,8 2,0

0,75 0,25 9,2 2,5

1,0 0,25 14,4 2,5

НСРоз 4,6 1,2

Лучшие результаты были достигнуты при сочетании 6-БАП-1 мг/л и кинетина - 0,25 мг/л. В этом случае число образовавшихся побегов было больше, чем в контрольном варианте.

Наиболее развитые экспланты были пересажены на среду для укоренения. Использование регуляторов роста ауксиновой природы обеспечивало в наших опытах высокую укореняемость побегов земляники на 20ый день культивирования. Сорт Зенга-Зепгтш одинаково хорошо укоренялся при использовании ИМК и И УК в концентрациях 0,5-1 мг/л. Сорта Тристар и Дукат на среде, содержащей ИУК - 1 мг/л по сравнению с контролем имели большее число укоренившихся эксплантов.

4.Чувствительность пролиферирующих культур земляники к гербицидам in vitro. В последние годы большее внимание уделяется возможности создания с помощью биотехнологических методов новых форм растений, в частности с помощью отбора сомаклональных вариантов с хозяйственно-ценными признаками. Отбор сомаклональных вариантов по признаку гербнцидоустойчивости может проводиться только после выявления летальных и сублетальных концентраций селективных агентов для культур клеток, тканей и органов.

Таких данных для земляники в литературе нами обнаружено не было, поэтому следующий этап работы был посвящён изучению чувствительности культивируемых in vitro тканей и органов различных сортов земляники к присутствию в питательной среде двух типов гербицидов.

Следует отметить, что гербииидный эффект испытанных препаратов сохранялся в культуре in vitro.

В случае использования симазина в диапозоне концентраций 2*10-5 - 2ХЮ 4М проявлялся ингибнрующий эффект в отношении роста и развития эксплантов. Концентрация 10-3М вызывала у эксплантов всех сортов вначале признаки хлороза вплоть до полного обесцвечивания с последующей гибелью.

Наиболее чувствительным к симазину оказался сорт Женева, для эхсплантов которого концентрация 1СИМ оказалась летальной (Табл.7).

Таблица 7

Состояние эксплантов различных сортов земляники (в баллах) в зависимости от присутствия в питательной среде гербицидов (1,5 месяца)

Концентрация гербицида (М)

Сорт Тип гербицида Контроль (без гербицида) О 2» 10* Ю-" 24 О-5 10-4 2*10-"

Зенга- Симазин 5,0 4,8 4,6 3,8 3,6 2,2

Зенгана Раундап 5,0 4,6 4,2 3,0 0 0

Дукат Симазин 5,0 4,8 4,5 4,2 3,8 2,5

Раувдап 5,0 4,4 4,2 3,0 0 0

Редгошлиг Симазин 4,9 4,6 4,4 4,1 3,6 2,4

Раундап 4,9 4,5 4,0 2,6 0 0

Гора Симазин 4,9 4,5 4,4 3,9 3,8 1,5

Эверест Раувдап 4,9 4,5 3,7 2,4 0 0

Женева Симазин 4,8 4,5 4,0 4,2 0 0

Раундап 4,8 4,5 3,3 1,9 0 0

Трисгар Симазин 4,9 4,6 4,3 4,2 3,8 0

Раундап 4,9 4,5 3,4 2,7 0 0

Трибыот Симазин 4,9 4,7 4,2 4,1 3,8 1,5

Раундап 4,9 4,5 3,6 3,0 0 0

При изучении эффекта присутствия в питательной среде раундапа было выявлено, что три наиболее высокие концентрации (Ю-4, 2*1 (КМ, 10"3М) приводили к полной гибели эксплантов.

Для подтверждения пониженной чувствительности отобранных эксплантов их пересаживали повторно на питательные среды, содержащие сублегальные концентрации соответствующих гербицидов. При последующем культивировании отобранных условно толерантных эксплантов различных сортов земляники наблюдалась гибель значительной части культур. Это свидетельствует о том, что в подавляющем большинстве случаев мы имеем дело не с устойчивыми к гербицидам органами и тканями, а с эксплантами, которые не успели погибнуть в предыдущем субкультивировании.

Известно, что гербициды подавляют многие процессы метаболизма в растениях, в частности оказывают существенное влияние на фотосинтетическую активность.

Симазин подавляет фотосинтез у растений за счёт связывания с так называемым 32К белком, входящим в состав тилакоидной мембраны. Учитывая механизм гербицидного действия, который основан на торможении реакции Хилла, мы провели серию экспериментов по влиянию его на фотосинтетическую активность.

Глифосат воздействует на синтез очень важных ароматических аминокислот, точкой его приложения является фермент 3 - фосфошикимат -1 карбоксивинилтрасфераза. Вероятно, подавление данной стадии метаболизма вызывает дефицит ароматических аминокислот, накопление шикимата и в результате при контакте с глифосатом на концентрации 10-3М -гибель эксплантов земляники.

Таким образом, нами определены селективные концентрации двух гербицидов: симазина - КИМ, раундапа - 10-5М.

5.Влияние гербицидов симазина и раундапа на фотосинтез изолированных побегов земляники in vitro. В процессе работы мы изучили влияние содержания пигментов в листьях земляники при культивировании с раундапом и симазином (Рис. 1).\Мы отмечали высокую чувствительность эксплантов сорта Женева. Такая повышенная чувствительность нашла отражение и в реакции фотосинтетического аппарата на содержание пигментов в листьях земляники.

На восьмую неделю культивирования в варианте с концентрацией раундапа 2Х106М отмечали стимулирующее действие этого препарата на содержание количества пигментов у эксплантов.

6. Адаптация микропобегов к нестерильным условиям в зависимости от сроков пер<зсадки. Для выявления лучших сроков приживаемости растения земляники каждый месяц переносили в нестерильные условия. Наблюдения, проведённые за дальнейшем развитием таких растений, выявили, что самым благоприятным сроком выведения пробирочных растений был период с мая по август. Например, в 1996 году высокий процент приживаемости был у сортов Тристар - 96%, Трибьют -93%. У сорта Редгонтлит в июле 1996 года на 20% повысилась приживаемость растений по сравнению с 1994 годом этого же месяца. Эксперименты показали, что растение, высаженное в мае-июне-июле быстро развивалось. Так, растения сорта Зенга-Зенгана (Рис.2), перенесённое в нестерильные условия 11 мая с длиной побегов 3,5 см, через 1,5 месяца имело длину побегов 9 см, крупные листья; ещё через месяц растения высаживали в полевые условия. При выведении эксплантов в нестерильные условия в марте, растениям требуется 3,5 месяца для высаживания в полевые условия, а это на один месяц больше, чем в первом варианте.

а 80 -60 -40 -20 -

хлорофилл а

хлорофилл Ь

каратиноиды

Рисунок 1. Содержание пигментов (%) в листьях земляники при культивировании на средах с раундапом и симазином в течение двух недель.

а) сорт Женева - контроль (без гербицидов) на средах с раундапом И - концентрация 2 10"6 М

б) сорт Женева "ЦЦр - концентрация 10"5 М на средах с симазином р! - концентрация 10"3 М

Сорт Зенга-Звнганнз

Рис.2 Приживаемость растений земляники в зависимости от срока пересадки в нестерильные условия (сорт Зенга-Зенгана)

При переводе эксплантов земляники в нестерильные условия осенью и зимой процент приживаемости был низкий. Например, у сорта Зенга-Зенгана в декабре (1996 г.) укоренившихся растений было меньше на 70% по сравнению с результатами мая (1996 г.); у сорта Дукат в январе укоренившихся растений меньше: на 55% по сравнению с маем (1996 г.). По данным за три года (1994-1996 гг.) мы можем отметить, что экспланты, пересаженные в нестерильные условия в осенне-зимний период имели низкий процент приживаемости.

По-видимому, отмеченное нами явление связано в первую очередь с невозможностью поддерживать в производственных культуральных помещениях (зимних теплицах) одинаковые условия (освещённость, спектральный состав света) на одном уровне в течение всего года. Нельзя

также исключить влияние внутренних биологических причин в поведении растений, связанных с ритмами роста и развития растений.

Таким образом, приживаемость растений при переносе в нестерильные условия зависела от способа и срока высадки. Использование оптимальных сроков переноса растений в нестерильные условия дают возможность повысить выход адаптированных растений до 30%. 7. Хозяйственно-биологическая оценка растений разных сортов земляники, полученных методом in vitro и обычным способом. Оценивая хозяйственно-биологическое значение сортов земляники, мы сравнивали влияние двух методов размножения растений разных сортов на урожайность, число розеток, массу ягод, количество плодов, поражённых гнилями (Табл.8).

Таблица 8

Хозяйственно-биологическая оценка растений земляники, полученных разными способами размножения____

Сорта Способ размножения Средняя урожайность содного растения за 1 год, г Среднее число розеток содного растения в1год вегетации Среднее число розеток с одного растения воПгод вегетации

Зенга-Зенгана in vitro 126 37 38

стандартный 125 30 37

Редгоитлит in vitro 108 57 52

стандартный 105 40 53

Дукат in vitro 95 18 19

стандартный 99 14 18

Тристар invito 199 21 21

стандартный 183 18 21

Трибьют invito 186 24 26

стандартный 178 23 25

Женева invito 177 20 19

стандартный 173 21 19

НСР05: сорта 26,5 года 8,9

взаимодействие 5,6

Эксперименты показали, что в 1 год выращивания у некоторых сортов земляники число розеток зависит от метода размножения, так у сорта Зенга-Зенгаиа число розеток от учётного растения было больше на 8 шт. По сравнению с растениями, полученными обычным методом. На второй год этот эффект сглаживался. Процент плодов, поражённых гнилями, был выше у сортов, имеющих две волны плодоношения: во-первых, сказывается резкое колебание ночных и дневных температур осенью в Ярославской области; во-вторых, влияет накопление патогена в растениях за весь период вегетации. По урожайности и массе ягод существенных отличий не было.

Экономические вопросы размножения земляники in vitro.

Метод клонального микроразмножения является достаточно трудоёмким и требует большого количества материальных затрат. Вместе с тем высокая рентабельность метода in vitro обусловлена экономией площадей культивационных помещений, сокращением периода выращивания растений, увеличением коэффициента размножения, улучшением качества продукции (ССЭ), а также работой в осенне-зимний период.

Оценку экономической эффективности производства посадочного материала с применением метода in vitro проводили на примере земляники сорта Зенга-Зенгана. Производственные затраты вычисляли на основе методических рекомендаций ВСТИСП (Табл. 9).

Расчёты показали, что при числе исходных эксплантов - 5 шт., коэффициенте размножения - 8, числе субкультивирований - 3 с учётом рада коэффициентов (коэффициент приживаемости эксплантов, выхода пригодных для укоренения побегов, укореняемое™, приживаемости при адаптации) в течение полугода по общепринятой технологии можно получить 5000 шт. Побегов. Себестоимость одного экспланта, выращенного по общепринятой технологии составит 1,22 руб.

Важным аспектом экономической эффективности технологии in vitro явилось снижение затрат труда на выращивание 1 тыс. шт. растений земляники in vitro.

Таблица 9

Экономическая оценка производства посадочного материала земляники с

использованием метода клоналыюго микроразмножения (1 тыс. шт.)

Показатели Метод in vitro

1. Себестоимость 1 шт., руб. 1,22

2. Себестоимость и накладные расходы (180%), руб. 1,68

3. Цена реализации 1 шт., руб. 7,2

4. Прибыль от 1 тыс. шт., руб. 5,52

5. Число микропобегов на 1 м2, шт. 1000

6. Прибыль на 1 м2, руб. 11,04

6. Уровень рентабельности, % 328

Таким образом, метод клоналыюго микроразмножения даёт

значительный экономический эффект, что показывает преимущество использования его в производстве.

1. Продолжительность периода освещения оказывает существенное влияние на развитие эксплантов земляники испытанных сортов. Среди изученных режимов культивирования продолжительность освещения 12 и 16 часов оказались наиболее благоприятными с точки зрения коэффициента размножения, длины образуемых побегов, количества листьев, а на этапе укоренения числа и длины корней.

2. Выращенные in vitro растения земляники при 16-ти часовом освещении давали существенно больше столонов, чем в случае культивирования при 12-ти часовом периоде, поэтому такие растения могут быть использованы в качестве исходных для закладки маточников. Растения, выращенные in vitro при 12-ти часовом освещении, характеризовались большим содержанием хлорофиллов

а, Ь и каратиноидов по сравнению с растениями, полученными при 16-ти часовом дне на 10%-30%.

3. При клональном размножении испытанных разных сортов земляники возможно снижение концентраций аммонийного азота в два раза по сравнению с базовой средой без ухудшения такого показателя развития, как коэффициент размножения

4. Для стимуляции бокового ветвления у эксплантов испытанных сортов земляники лучшие результаты даёт сочетание 6-БАП в концентрации 1 мг/л с кинетином 0,25 мг/л.

5. Включение в питательные среды гербицидов различного спектра действия -раундапа и симазина в концетрациях 2Х106М - 10"3М - оказывало существенное влияние на ростовые процессы у культивируемых эксплантов земляники. Раундап обладал более фототоксичным эффектом и вызывал гибель основной массы эксплантов в концентрации 2*1 (ИМ. Селективной концентрацией симазина является 10^М, раундапа 10~5М для испытанных семи сортов земляники. Эти исследования могут стать основой для отбора форм земляники с повышенной устойчивостью к гербицидам.

6. Присутствие в питательных средах гербицидов раундапа и симазина на уровне концентраций 105, 10~3М ингибировало синтез хлорофилла а, хлорофилла b и каратиноидов. Концентрация 2Х10"6М раундапа на восьмую неделю культивирования приводила к увеличению количественного содержания хлорофилла а и хлорофилла Ь.

7.0пределены наиболее благоприятные сроки для перегадай микроразмноженных растений в нестерильные условия с мая по август, что даёт возможность повысить выход адаптированных растений на 20% и более.

8. Оценка состояния растений в полевых условиях показала, что в первый год выращивания у растений сортов Зенга-Зенгана, Дукат, Профъюжен, Хомдей, Редгонтлит число розеток зависит от метода размножения. У растений, выращенных in vitro количество розеток было больше приблизительно в 1,3

раза. На второй год вегетации различия по числу образуемых розеток у всех исследуемых сортов земляники сглаживались. Существенных различий по урожайности испытанных сортов в зависимости от способа размножения не выявлено.

При размножении методом in vitro растений земляники рекомендуем в питательной среде Мурасиге-Скуга снизить концентрацию аммонийного азота до 825 мг/л. Для обеспечения массового размножения побегов оптимальная комбинация регуляторов роста 6-БАП и кинетина 1 мг/л, 0,25 мг/л соответственно.

Пересадку пробирочных растений в нестерильные условия необходимо проводить с мая по август.

Для отбора сомаклональных вариантов и трансгенных экземпляров с повышенной гербицидоусгойчивостью использовать в питательной среде следующие концешрации гербицидов: раувдапа - 2Х10"5, Ю"5М; симазина - 2М0"4, 1(НМ.

1. Хапова С. А. Влияние условий культивирования на клональное микроразмножение земляники и процессы её адаптации к нестерильным условиям // Тезисы докладов Всероссийского совещания "Молодые учёные -садоводству России". - М. -1995. - С.156-158

2. Хапова С.А. Влияние гербицидов на фотосинтез и развитие эксплантов

земляники in vitro // Материалы IV Международной конференции "Проблемы дендрологии, цветоводства, плодоводства, виноградарства и виноделия". -Ялта,-1996.-Т.2.-С.61-63

3. Khapova S. Tissue-culture strawbeny no virus // The 18 th International group training on

plant protection services. - Thailand. -1996. - Т. 1. - P.M-M3

4. Высоцкий В.А., Хапова С.А. Чувствительность культур изолированных органов земляники к гербицидам / Сб. труд. ВСТИСП. - М.; -1997. - С.83-89

5. Хапова С.А. Влияние состава субстрата и сроков пересадки в нестерильные

условия на приживаемость пробирочных ратсений земляники // Тезисы докладов научной конференции ЯрСХА. - Ярославль. -1997.

6. Хапова С.А. Реакция изолированных побегов земляники на присутствие гербицидов в питательной среде // Тезисы докладов VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда". -1997. - С.382-383

7. Хапова С.А. Влияние светового режима на морфологию и ситез пигментов

растений земляники в полевых условиях // Материалы VI Международной научно-практической конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье". - Симферополь. -1997. - Т. 1-2. - С. 140-141

О возможностях биотехнологии рассказывает к.с.-х.н. Дмитрий Кравченко из ВНИИ картофельного хозяйства.

Рост и развитие под контролем:

возможности биотехнологии картофеля in vitro

Регуляция роста и развития растений - важная задача современной биологии. Изучение регуляторных механизмов на клеточном уровне, контролирующих основные жизненные функции растения, путей управления физиологическими процессами, регуляторными механизмами растительной клетки открывает широкие перспективы для использования потенциальных возможностей.

Зачем нужна работа in vitro ?

Биотехнологические методы, связанные с культивированием в условиях in vitro , стали неотъемлемой частью технологического процесса воспроизводства исходных растений для оригинального семеноводства картофеля. Для оздоровления методами апикальной меристемы и ускоренного размножения культуры in vitro с целью получения возможно большего количества оздоровленного исходного материала для дальнейшего ведения процесса семеноводства необходимо оптимизировать и активизировать процессы роста и развития растений картофеля как в условиях in vitro , так и при получении оздоровленных мини-клубней.

Зачем нужно управлять ростовыми процессами? Назовем основные направления работы с культурой картофеля in vitro :

— оздоровление сортов картофеля от вирусной и иной инфекции (метод апикальной меристемы в различных сочетаниях и модификациях);

— введение в культуру in vitro эксплантатов, полученных от абсолютно здорового картофельного растения;

— микроклональное размножение сортов картофеля в процессе оригинального семеноводства;

— получение микроклубней картофеля;

— длительное поддержание коллекций генотипов картофеля;

— селекционно-генетические и другие исследовательские работы, требующие для своего выполнения материал in vitro .

Ионы Скулачева

Рассмотрим возможности управления ростовыми процессами растений in vitro на этапах оздоровления и микроклонального размножения.

На этапе получения регенерантов из меристематических эксплантов определяющее значение имеют показатели приживаемости объектов, интенсивности процессов их морфогенеза и времени регенерации. Для улучшения данных параметров мы рекомендуем применять новый класс нанопродуктов с геропротекторными свойствами - ионов Скулачева. Синтезированные в НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского (МГУ имени М.В. Ломоносова) препараты SkQ (ионы Скулачева) представляют собой соединения катионов трифенилдецилфосфония и аналогов пластохинона хлоропластов. Они регулируют внутриклеточный баланс активных форм кислорода и различаются по проникающей способности и соотношению анти- и прооксидазной активности.

Добавление препарата SkQ1 в искусственную питательную среду в наноконцентрации 2,5 нМ улучшает приживаемость меристемных эксплантов сортов с более коротким вегетационным периодом на 16–43% и сортов с более длинным вегетационным периодом - на 7–13%.

Одновременно наблюдается значительное повышение морфогенной активности и интенсивности роста эксплантов, в результате чего время регенерации микрорастений из меристемных тканей сокращается на 24 – 30 дней .

После пересадки на новую питательную среду микрорастения из регенерантов, полученных с использованием SkQ1 , характеризовались более быстрым ростом и лучшими биометрическими параметрами. По комплексу показателей лидировали растения, полученные в средах: для начального роста меристем и для дальнейшего роста растений.

Еще быстрее

Таким образом, через 50 дней после вычленения меристем при использовании препарата SkQ1 получены полноценные растения, пригодные для дальнейшего черенкования и проверки на скрытую зараженность вирусами методом ИФА. А еще через 15–20 дней после черенкования отросшие растения можно было высаживать в грунт теплицы или открытый грунт для оценки сортовой типичности и получения мини-клубней. Следовательно, общее время от вычленения меристемы до высадки здоровых растений в грунт можно сократить до 65–80 дней. Увеличивается и количественный выход линий, а значит, вероятность успешного оздоровления.

Автоматизированная система Фитотрон ТФ 600 позволяет получать подобные результаты без применения дополнительных ростостимулирующих веществ, а в сочетании с ними морфогенная активность регенерантов повышается на 12–21%, время получения исходных здоровых растений сокращается на 7–14 дней.

Кроме того, в настоящее время проводятся исследования по влиянию светового излучения различного спектрального состава на снижение вирусной зараженности в растениях in vitro .

Разгоняющие черенкования

После получения оздоровленных исходных растений-регенерантов следующий важный этап воспроизводства - их дальнейшее размножение. При этом задача состоит в быстром увеличении объемов исходного материала при одновременном сохранении высокой потенциальной энергии роста и продуктивности, а также статуса отсутствия патогенов.

Процесс микроклонального размножения следует разбить на 2 этапа: разгоняющие черенкования и последнее черенкование перед высадкой в условия in vivo . Разгоняющие черенкования должны действительно обеспечить максимальный коэффициент размножения в заданные программой семеноводства сроки. В последнем же пассаже предстоит сформировать растения, которые впоследствии будут наилучшим образом адаптированы к условиям выращивания в грунте и дадут высокий урожай стандартных мини-клубней. Поэтому на разных этапах микроразмножения могут применяться разные химические регуляторы и разные физические условия культивирования.

Обеспечить условия

По результатам ранее проведенных исследований мы рекомендовали для разгоняющих черенкований применять препарат эпин (синтетический эпибрассинолид), который ускоряет стеблевой морфогенез растений in vitro и повышает коэффициент размножения. На последнем этапе черенкования рекомендован препарат фумар (диметиловый эфир аминофумаровой кислоты), который стимулировал ризогенез у растений картофеля и обладал пролонгированным положительным эффектом в последействии, повышая урожайность картофеля в полевых питомниках на 9–15%.

Путем тщательного изучения синтезированных в последние годы росторегулирующих веществ нового поколения выявлен препарат, способный при добавлении в искусственную питательную среду увеличивать число листочков микрорастений картофеля, а следовательно и коэффициент размножения, до 9–15 шт. в зависимости от сорта .

Однако подобных результатов возможно достичь при культивировании растений in vitro на стандартной питательной среде Мурасиге-Скуга при оптимизации всех физических параметров выращивания, что может обеспечить установка Фитотрон ТФ 600 .

Можно, но осторожно

Таким образом, действенным инструментом в арсенале манипуляций с объектами в культуре in vitro стало применение биологически активных веществ, оказывающих направленное воздействие на физиологические процессы и механизмы регуляции внутриклеточного обмена веществ. Однако следует учитывать, что многие биологически активные вещества обладают в той или иной степени выраженным мутагенным эффектом. Следует с особой тщательностью и осторожностью подбирать их для тех направлений работы с культурой in vitro , в которых стабильность сортовых признаков картофеля подвергается наибольшему риску.

С другой стороны, внедрение в практику оригинального семеноводства картофеля современных технологических решений, таких как камеры с регулируемыми физическими условиями (Фитотрон ТФ 600 и его аналоги), позволяет частично решить задачу управления ростовыми процессами растений in vitro без применения химической регуляции.

В. В. Роговая, М. А. Гвоздев

ОСОБЕННОСТИ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КОСТОЧКОВЫХ КУЛЬТУР В УСЛОВИЯХ IN VITRO

В работе представлен обзор, в котором рассматриваются особенности методов микроклонального размножения косточковых плодовых культур в системе in vitro. Особое внимание уделено методу размножения пазушными почками и методу регенерации адвентивных побегов из листовых эксплантов вишни, черешни, персика и абрикоса. Рассмотрены вопросы оздоровления растений от различных патогенов и тестирования растительного материала косточковых культур на наличие вирусных инфекций.

Впервые микроклональное размножение провел французский ученый Жорж Морель на орхидеях в 50-х годах ХХ века. В своих работах он использовал технику культивирования апикальной меристемы растений. Растения, полученные таким образом, были свободны от вирусной инфекции.

В нашей стране исследования по оздоровлению растений методом меристем и по клональному микроразмножению начались в 60-х годах в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР .

Микроклональное размножение - получение in vitro растений, генетически идентичных исходному экспланту (метод вегетативного размножения растений в культуре in vitro). В основе микроразмножения лежит уникальное свойство соматической растительной клетки - тотипотентность - способность клеток полностью реализовать генетический потенциал целого организма .

В настоящее время все большую актуальность приобретают различные методы микроклонального размножения сельскохозяйственных культур (прежде всего вегетативно размножаемых) в системе in vitro: размножение пазушными и адвентивными почками, непрямой морфогенез, соматический эмбриогенез.

Использование этих методов дает возможность:

Ускорять селекционный процесс, в результате этого сроки получения товарной продукции сокращаются до 2-3 лет вместо 10-12;

Получать за короткий срок большое количество оздоровленного, безвирусного материала, генетически идентичного материнскому растению;

Работать в лабораторных условиях и поддерживать активно растущие растения круглый год;

Размножать растения практически без контакта с внешней средой, что исключает воздействие неблагоприятных абиотических и биотических факторов;

Получать максимальное число растений с единицы площади;

В короткий срок получать большое число растений трудноразмножае-мых или вегетативно неразмножаемых;

При выращивании растений с длительной ювенильной фазой можно ускорять переход от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

Длительно (в течение 1-3 лет) сохранять растительный материал в условиях in vitro (без пассирования на свежую среду) ,

Создавать банки длительного хранения ценных форм растений и отдельных их органов;

Разрабатывать методы криосохранения оздоровленного in vitro материала .

Этапы микроклональногоразмножения косточковых плодовых культур и тестирование на наличие вирусных инфекций

Процесс микроклонального размножения включает несколько этапов. Основными из них являются :

1-й этап - введение экспланта в культуру in vitro;

2-й этап - микроразмножение;

3-й этап - процесс укоренения микропобегов;

4-й этап - осуществление выхода укорененных растений из стерильных условий в нестерильные.

Важным этапом в методике микроразмножения растений in vitro является выращивание безвирусных маточных форм растений в вегетационных домиках или изолированных боксах в зимних теплицах, в условиях, недоступных для переносчиков вирусов. Растения-доноры эксплантов для последующего введения в культуру in vitro должны быть протестированы на наличие вирусных, ми-коплазменных и бактериальных инфекций с помощью методов ПЦР-диагностики либо молекулярной гибридизации, либо иммуноферментного анализа (ИФА) .

Метод ИФА позволяет в сжатые сроки выявлять подавляющее большинство вирусов, заражающих косточковые культуры: вирусы карликовости сливы, некротической кольцевой пятнистости косточковых, потивирус шарки слив, не-повирусы скручивания листьев черешни. Клоны, оказавшиеся свободными от контактных вирусов по результатам проверки методом ИФА, подвергают затем основному тестированию, включающему серологические тесты в сочетании с тестом на растениях-индикаторах. Растениям, оказавшимся по результатам тестирования свободными от вирусов и других регламентируемых патогенов, присваивается категория «безвирусных» базисных клонов. В случае выявления инфекции исходные растения могут подвергнуть оздоровлению. Для оздоровления растений косточковых культур от вирусов наиболее целесообразно сочетать методы суховоздушной термотерапии и культуры in vitro. Если с помощью культуры изолированных апикальных меристем не удается освободиться от тестируемых вирусов, используют методы хемотерапии, основанные на введении в питательные среды химических веществ, ингибирующих развитие вирусной инфекции в растениях in vitro .

Иногда для активного выявления бактериальной микрофлоры среды обогащают различными органическими добавками, например гидролизатом казеина, который провоцирует развитие сапрофитных микроорганизмов . Оценку зараженности проводят визуально через 7-10 дней. «Чистые» экспланты помещают на питательные среды для дальнейшего культивирования. Практикуют на этой ступени и применение сред, лишенных ростовых веществ .

Введение в культуру in vitro и микроразмножение плодовых косточковых культур

При клональном микроразмножении плодовых косточковых культур в качестве источника эксплантов обычно используют верхушечные и боковые почки, а также меристематические верхушки. Вычленение верхушечной меристемы проводят по общепринятым методикам после ступенчатой стерилизации растительного материала .

Для микроклонального размножения косточковых культур используют различные среды: для микроразмножения вишни - среды Пиерика, Готре, Уайта, Хеллера , для вишни и сливы - среду Розенберга, модифицированную для плодовых культур и для сливы - среду Лепуавра и В5 . Но наиболее подходящей для микроклонального размножения вишни, черешни и сливы является питательная среда Мурасиге-Скуга (МС) .

В зависимости от этапа микроклонального размножения плодовых косточковых культур к питательным средам добавляют 6-бензиламинопурин (6-БАП) в концентрациях 0,2-2 мг/л . На этапе введения в культуру in vitro используют более низкую концентрацию цитокинина - 0,2 мг/л БАП . Для индукции пролиферации пазушных почек с целью получения максимального числа побегов микрорастения вишни культивируют с добавлением БАП, в концентрациях 0,5-2 мг/л , микрорастения сливы 0,5 - 1 мг/л БАП .

Процесс укоренения микропобегов

Особого внимания требует этап укоренения. Процесс укоренения in vitro побегов плодовых косточковых культур зависит от сортовых особенностей , от числа проведенных пассажей, от концентрации и типа ауксина, от способа его применения . Для получения полностью сформированных микрорастений плодовых косточковых культур из среды исключается 6-БАП, препятствующий процессам ризогенеза, и в среды вводятся ауксины, в основном - в-индолил-3-масляная кислота (ИМК) . Установлено, что оптимум концентраций ИМК в составе питательной среды находится в пределах 0,5-1 мг/л . Присутствие в среде ИМК в концентрации 2 мг/л вызывает образование гипертрофированных корней .

Совместное введение в среду для укоренения препарата рибав (1 мл/л) и традиционных фитогормонов ауксинов [ИМК и в-индолилуксусной кислоты (ИУК) по 0,5 мг/л каждого] повышает процент укоренения побегов ряда сортов косточковых культур .

При сравнительном изучении индукторов корнеобразования: ИМК, ИУК и а-нафтилуксусной кислоты (НУК), была выявлена высокая эффективность ИУК в концентрации 6,0 мг/л . Наибольшее число укоренившихся микрочеренков вишни было получено на среде, содержащей НУК . Однако при этом на базальном участке побегов происходило интенсивное разрастание каллуса, что затрудняло перенос пробирочных растений с корнями в нестерильные условия.

Для эффективного укоренения пробирочных растений косточковых культур большое значение имеет не только тип стимулятора, но и способ его аппликации. Помимо введения ауксинов в питательную среду, для индукции ризоге-неза используют предварительное замачивание побегов в стерильном водном растворе ИМК (25-30) мг/л при экспозиции 12-24 часа . Проведенные эксперименты показали, что обработка микрочеренков водным раствором ИМК более эффективна, чем введение этого регулятора в культураль-ную среду. Массовое появление первых придаточных корней при применении предварительной обработки индуктором ризогенеза отмечалось на 20-25 день . Еще одним способом индукции ризогенеза является обработка побегов плодовых косточковых культур тальковой ауксинсодержащей пудрой ИМК с концентрацией 0,125%, 0,25% и ИУК с концентрацией 0,25%, 0,5% . При использовании гормональной пудры отмечалась высокая эффективность и технологичность применения индукторов ризогенеза . Но использование тальковой пудры ИМК с разными концентрациями ауксина выявило сортовую специфику при укоренении микрочеренков сливы .

Процесс ризогенеза наиболее интенсивно протекает на модифицированных средах МС и Уайта . По другим данным лучшей средой для корнеобразования являются среды с макроэлементами по Хеллеру с добавлением витаминов и разбавленная вдвое среда МС с пониженным содержанием сахарозы 15 мг/л и с исключением мезоинозита, способствующего образованию каллусной ткани. Однако в большинстве работ для укоренения микропобегов косточковых культур используется среда Мурасиге и Скуга .

Методы микроклонального размножения

Существует несколько способов микроклонального размножения растений in vitro:

Методы размножения пазушными почками;

Методы размножения адвентивными почками;

Непрямой морфогенез;

Соматический эмбриогенез.

Для любого типа регенерации in vitro можно выделить четыре группы факторов, определяющих ее успех: генотип и состояние исходного родительского растения; условия и методы культивирования; состав питательных сред; особенности введения экспланта в стерильную культуру .

Влияние генотипа на эффективность микроразмножения

Наиболее существенное влияние на эффективность микроразмножения оказывает генотип. Реакция растений на условия асептического культивирования зависит от сортовых особенностей и объясняется разной регенераци-онной способностью сортов плодовых и ягодных культур . Например, при использовании метода клонального микроразмножения для ускоренного размножения новых сортов вишни сортовые особенности оказались доминирующими факторами в способности растений к микроразмножению .

Сортовые различия проявлялись как на стадии пролиферации, так и на стадии корнеобразования .

Среди эксплантов разных сортов одного и того же вида плодовых растений нередко наблюдается разная степень проявления реакции на включаемые в среду регуляторы роста, что, видимо, отражает, в какой-то мере эндогенное содержание ростовых веществ, которое является генетически обусловленным признаком вида или сорта . В то же время реализация морфогенетического потенциала в культуре зародышей in vitro, у гибридов между видами Cerasus vulgaris, C. maackii, C. fruticosa, Padus racemosa в основном определялась генотипом и в меньшей степени зависела от состава питательной среды .

Условия культивирования

Еще одним фактором, определяющим успех микроразмножения растений, являются условия их культивирования. Оптимальными условиями культивирования косточковых плодовых культур являются: температура 22-26 °С для вишни, черешни и 26-28 °С - для сливы , освещенность 2000-5000 лк - для вишни, черешни и 3500 лк для сливы при 16-часовом фотопериоде. Микрорастения должны выращиваться в климатических камерах или в комнатах с регулируемым режимом.

Необходимо отметить, что у сортов вишни на этапе пролиферации увеличение коэффициента размножения и повышение доли побегов, пригодных к укоренению, может обеспечить прием чередования минеральных составов питательных сред и использование ламп синего света (ЛП 1) . Большое количество побегов косточковых культур - до 30 - может образовываться при горизонтальной ориентации регенерантов . Для увеличения коэффициента размножения в первых пассажах конгломераты почек и побегов косточковых культур можно не разделять на отдельные единицы, а переносить на свежую питательную среду целиком. При использовании этого приема величина коэффициента размножения резко возрастает и может достигать 40-70 за пассаж в зависимости от сорта .

Методразмножения пазушными почками непрямой морфогенез

Самым надежным методом микроклонального размножения является метод регенерации растений через развитие пазушных почек . Преимущество этого метода состоит в сравнительно быстром размножении исходного генотипа, при этом обеспечивается наиболее высокая фенотипическая и генотипиче-ская стабильность. Потенциальные возможности такого способа микроразмножения in vitro реализуются при добавлении в питательные среды цитокининов, которые подавляют развитие верхушечной почки стебля и стимулируют образование пазушных почек .

В основе процесса микроклонального размножения вишни методом культуры изолированных верхушечных меристем лежит явление снятия апикального доминирования, что способствует последующему развитию уже существующих меристем и обеспечивает генетическую однородность посадочного мате-

риала. Снятие апикального доминирования достигается путем добавления ци-токининов. Для многих сортов вишни характерна высокая митотическая активность апекса, что способствует формированию разветвленного конгломерата почек и боковых микропобегов .

Генетическая стабильность получаемого in vitro материала зависит от модели размножения. Процесс размножения плодовых косточковых растений связан с пролиферацией пазушных меристем. Генетическая стабильность - неотъемлемое свойство меристемы, которое может быть сохранено in vitro, если последняя культивируется в условиях, ингибирующих формирование каллуса. Если используются среды, стимулирующие образование каллуса, то может возникнуть генетическая вариабельность .

Для получения более высоких коэффициентов размножения питательные среды часто обогащают кроме препаратов цитокининовой природы веществами из группы ауксинов, стимулирующими развитие каллусной ткани. Комбинации этих двух препаратов применяют для индукции органогенеза в каллусных тканях. В системе каллус-побег организованная структура побега может воздействовать на процессы органогенеза, стимулируя меристематизацию каллусных клеток, которые могут давать начало органам с измененными свойствами. Простое варьирование содержания регуляторов роста, добавляемых к питательной среде для достижения максимальной пролиферации клеток, может оказывать влияние на генетическую стабильность получаемого материала .

Метод размножения адвентивными почками и непрямой морфогенез

Адвентивными почками называются почки, возникшие непосредственно из тканей и клеток эксплантов растений, обычно их не образующих . Адвентивные (или придаточные) почки образуются из меристемных зон, чаще всего сформированных вторично из тканей каллуса. Адвентивные почки могут возникнуть из меристемы и немеристемных тканей (листьев, стеблей). Образование адвентивных почек у многих видов растений индуцировано высоким отношением цитокининов к ауксинам в питательной среде.

Регенерация побегов, корней или эмбриоидов из соматических растительных клеток экспланта может происходить через непрямую регенерацию - образование каллуса и формирование побегов, или через «прямую» регенерацию, когда клетки экспланта становятся способными к регенерации без формирования каллусных тканей .

Адвентивные побеги могут образовываться на эксплантах листьев, черешков, корней и других органов растений различных видов косточковых и плодовых культур . Получение побегов непосредственно из эксплантов в ряде случаев используют для клонирования растений, но при этом могут появляться генетически нестабильные растения . Поэтому указанный метод регенерации растений можно применять для индукции генетически разнообразных растений.

Побеги-регенеранты могут быть индуцированы из различных частей листовой пластинки, но наибольшей способностью к регенерации обладают ткани

основания листа, поскольку в этой зоне листовой пластинки расположены наиболее активные меристематические клетки. Необходимо также учитывать, что морфогенетический потенциал листьев увеличивается по мере их расположения к верхушке стебля. Придаточные побеги лучше регенерируют из молодой меристематической ткани развивающихся листьев. Однако при использовании более старых листьев значительно чаще возникают генетически измененные побеги .

Для регенерации побегов плодовых косточковых культур, таких как вишня, черешня, персик, абрикос, из исходных эксплантов (целых листьев и их сегментов) используются различные среды: Мурасиге-Скуга (МБ), Ллойда и Мак Коуна (WPM), Драйвера и Куниюки (DKW), Курена и Лепуав-ра (QL) .

Для экспериментов по адвентивной регенерации вишни и черешни чаще всего используется среда Ллойда и Мак Коуна для древесных растений - Woody Plant Medium (WPM), дополненная различными стимуляторами роста . Из цитокининов в основном используют 6-БАП, тидиазурон (TDZ), из ауксинов - НУК , ИМК , 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) .

Важно отметить, что среди зарубежных исследователей нет единого мнения об эффективности применения в регенерации побегов TDZ по сравнению с БАП, о типе экспланта (целые листья, с нанесенными на них поперечными разрезами или сегментированные) и о способе культивирования экс-плантов (абаксиальной или адаксиальной поверхностью вверх).

Высокий процент регенерации наблюдался у целых листовых эксплантов черешни (с нанесенными на них поперечными разрезами вдоль центральной жилки листа), которые помещали абаксиальной (нижней) поверхностью вверх на среду WPM, дополненную 2,27 или 4,54 |М TDZ + 0,27 |М НУК .

С другой стороны, в работе показано, что БАП более эффективен, чем TDZ, в регенерации растений из листьев вишни и черешни а также то, что БАП и НУК в концентрации 2 мг/л и 1мг/л являются оптимальной комбинацией регуляторов роста растений вишни и черешни. Наибольшая частота регенерации была получена на среде WPM, хотя она стимулировала каллусогенез больше, чем среды MS, QL, DKW. Выявлена зависимость эффективности каллусообра-зования от типа листовых сегментов. Так, наиболее высокие показатели каллу-сообразования отмечены на средних листовых сегментах; наиболее низкие - на верхушечных сегментах и прямая регенерация (без образования каллуса) отмечена на базовых сегментах.

Адвентивная регенерация вишни черной (Prunus serótina Ehrh.) происходила чаще при культивировании эксплантов листьев на среде WPM, дополненной TDZ по сравнению с модифицированной средой DKW .

На эффективность адвентивной регенерации дикой вишни (Prunus avium L.) существенное влияние оказывал размер экспланта. Результаты показали, что размер листового экспланта имеет критическое значение для образования адвентивных побегов, листья длиной 3-5 мм формировали наибольшее число адвентивных побегов. Для адвентивной регенерации дикой вишни использовалась среда WPM, дополненная 0,54 тМ НУК и 4,4 тМ TDZ .

Специальная предварительная обработка до культивирования (замачивание с добавлением 5 мг/л 2,4-Д в течение одного дня) оказалась эффективной для индукции адвентивных побегов из листовых эксплантов черешни . Последующее культивирование эксплантов листьев на регенерационной агаризо-ванной среде WP, дополненной 5 мг/л TDZ, повышало эффективность адвентивной регенерации черешни. Молодые листовые экспланты черешни показали более высокую способность к регенерации, чем старые.

Необходимо отметить существенное влияние этиленовых ингибиторов на адвентивную регенерацию листьев различных сортов абрикоса. Например, в работе было показано, что применение этиленовых ингибиторов (тиосульфата серебра или аминоэтоксивинилглицина) совместно с низким содержанием канамицина увеличивает адвентивную регенерацию более чем на 200%. Использование чистого агара также улучшало регенерацию из листьев абрикоса по сравнению с использованием агар-геля или агарозы. В данной работе исследования проводились на средах LQ, DKW, дополненные TDZ и НУК. Способ культивирования листьев - адаксиальной поверхностью к среде.

Итальянскими исследователями был разработан метод адвентивной регенерации из целых листьев персика, которые инкубировались в темноте на средах, дополненных 6-БАП и НУК. В исследованиях использовались комбинации макросолей и микросолей различных сред по MS, Quoirin, Rugini и Muganu, оба цитокинина - 6-БАП и TDZ, а также способ культивирования листьев - адаксиальной поверхностью в контакте с регенерационной средой. В основании черешков листьев развивался каллус. Адвентивные побеги появлялись на этом каллусе после переноса на среду, не содержащую ауксин, и культивирования на свету. Морфогенетическая способность каллуса сохранялась в течение нескольких месяцев. В данных исследованиях адвентивные побеги персика появлялись путем непрямого морфогенеза.

Непрямой морфогенез включает вторичную дифференциацию почек из каллусных тканей. Для образования каллуса, из которого затем формируются побеги, используют разнообразные экспланты. Для получения морфогенного каллуса у многолетних растений следует брать верхушки побегов или выделенные из них участки меристематических тканей. Такая система не рекомендуется для микроклонального размножения растений in vitro из-за генетической нестабильности. Непрямой морфогенез имеет значение для изучения сомаклональ-ной изменчивости и получения сомаклональных вариантов .

В Великобритании, в отделе физиологии экспериментальной станции Мейдстон, изучалась регенерация растений из стеблевого и листового каллуса у подвоя черешни Кольт. Инициацию каллуса осуществляли на среде Му-расиге-Скуга, содержащей 2,0-10,0 мг/л НУК. Образовавшийся каллус переносили на среду для регенерации, которая содержала БАП в концентрации 0,5 мг/л. Удалось осуществить регенерацию побегов из каллусов у данного подвоя черешни .

В Центральной генетической лаборатории имени И. В. Мичурина в культуре пассированных каллусных тканей, полученных из однолетних побегов вишни, отмечалось корнеобразование. При пересеве на среду с регуляторами роста наблюдалось появление меристематических образований .

Соматический эмбриогенез

Еще одним методом микроклонального размножения растений in vitro является соматический эмбриогенез - процесс формирования зародышеподоб-ных структур из соматических (неполовых) клеток. Соматический зародыш - независимая двухполюсная структура, физически не прикрепленная к ткани, из которой образуется структура, в которой одновременно развиваются апексы стебля и корня.

Образование соматических зародышей в культуре клеток, тканей и органов может происходить прямым или непрямым путем. Прямой соматический эмбриогенез - формирование вегетативного зародыша из одной или нескольких клеток ткани экспланта без стадии образования промежуточного каллуса. Непрямой эмбриогенез состоит из нескольких этапов: помещение экспланта в культуру, последующая стимуляция роста каллуса и формирование из каллус-ных клеток предзародышей, перенос каллуса на питательную среду без факторов роста для формирования биполярных зародышей из предзародышей .

В работе исследовалась возможность регенерации растений из каллусов, полученных из корней подвоев вишни. Каллус получали либо из срезанных корешков, либо из целых растений, выращенных в стерильных условиях при микроклонировании побегов вишни. У подвоя вишни Кольт каллус, полученный из корней интактных растений, образовывал побеги и эмбриоидо-подобные структуры. Каллусы вишни культивировали на среде Мурасиге-Скуга, дополненной БАП, ГК и НУК. Частота образования побегов была выше, чем у анализированной параллельно яблони. Растения-регенеранты были размножены через культуру тканей и пересажены в почву. Саженцы растений-регенерантов, полученные из каллусов подвоя вишни по фенотипу, не отличались от исходных подвоев.

Индукцию соматического эмбриогенеза у сортов вишни (Prunus cerasus L.) наблюдали при культивировании эксплантов на среде Мурасиге-Скуга, дополненной различными комбинациями ауксинов и цитокининов . Соматический эмбриогенез в основном происходил, когда использовали комбинацию 2,4-Д и кинетин. Индукция соматического эмбриогенеза также отмечена при добавлении 0,1 мг/л ИМК в индуктивную среду. Использование НУК или 6-БАП уменьшало индукцию соматического эмбриогенеза и увеличивало частоту непрямой регенерации у сортов вишни (Prunus cerasus L.).

На сегодняшний день самым надежным способом получения генетически идентичного потомства считается микроклональное размножение плодовых косточковых культур пазушными почками по сравнению с соматическим эмбриогенезом, размножением адвентивными почками и непрямым морфогенезом.

1. Полевой В. В., Чиркова Т. В., Лутова Л. А. и др. Практикум по росту и устойчивости растений: Учебное пособие. СПб., 2001. С. 208.

2. Сорокина И. К., Старичкова Н. И., Решетникова Т. Б., Гринь Н. А. Основы биотехнологии растений. Культура растительных клеток и тканей: Учебное пособие. 2002. С. 45.

3. Чернец А. М., Абраменко Н. М., Стаканова Р. В. Разработка метода длительного хранения in vitro безвирусных клонов плодовых пород и земляники // Тезисы докладов международной конференции: Биология культивируемых клеток и биотехнология. Новосибирск, 1988.

4. Романова Н. П., Ульянова Е. К. К вопросу о хранении мериклонов земляники in vitro // Научно-технический бюллетень Научно-исследовательского института растениеводства имени Н. И. Вавилова. Л., 1990. Вып. 204. С. 75-79.

5. Орлова С. Ю. Биологические особенности и селекционная ценность сортов вишни в условиях северо-запада России: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб., 2002. С. 20.

6. Niino Takao, Tashiro Kazuo, Suzuki Mitsuteru, Ohuchi Susumu, Magoshi Jun, Akihama Tomoya. Cryopreservation of in vitro grown shoot tips of cherry and sweet cherry by one-step vitrification // Scientia Horticulturae. 1997. Vol. 70. P. 155-163.

7. Высоцкий В. А. Культура изолированных тканей и органов плодовых растений: оздоровление и микроклональное размножение // Сельскохозяйственная биология: Ежемесячный научно-теоретический журнал. М., 1983. № 7. С. 42-47.

8. Фаустов В. В., Олешко Е. В, Жаркова И. В., Асадулаев З. М., Шарафутдинов Х.

B., Исмаил Х. Микроклональное размножение вишни // Известия ТСХА. М., 1988. Выпуск 5. С. 131-148.

9. Биотехнология растений: культура клеток // Пер. с англ. В. И. Негрука / Под ред. Р. Г. Бутенко. М., 1989. С. 233.

10. Деменко В. И., Трушечкин В. Г. Размножение вишни методом in vitro // Сельскохозяйственная биология: Ежемесячный научно-теоретический журнал. М., 1983. № 7.

11. Кашин В. И., Борисова А. А., Приходько Ю. Н., Суркова О. Ю., Упадышев М. Т. и др. Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур: Методические указания. М., 2001. С. 97.

12. Шипунова А. А. Клональное микроразмножение плодовых растений: Автореф. дис. ... канд. сельскохозяйственных наук. М., 2003. С. 24.

13. Трушечкин В. Г, Высоцкий В. А., Олешко Е. В. Микроклональное размножение сортов и подвоев косточковых культур: Методические указания. М., 1983. С. 16.

14. Lane W. D. Regeneration of pear plants from shoot meristemtips // Plant Sci. Letters. 1979. Vol. 16. № 2/3. Р. 337-342.

15. FossardR. A., Bourne R. A. Reducing tissue culture costs for commercial propagation // Tissue culture for horticultural purposes. Acta Hort. 1977. Vol. 78. Р. 37-44.

17. Олешко Е. В. Особенности клонального микроразмножения подвоев и сортов вишни: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 1985. С. 15.

18. Хаак Э. Р., Нууст Ю. О. Клональное микроразмножение косточковых культур // Садоводство и виноградарство. М., 1989. № 1. С. 27-29.

19. Дудченко О. П. Регенерация в культуре изолированных меристем сливы // Тезисы докладов Международной конференции «Биология культивируемых клеток и биотехнология 2». Новосибирск, 1988. С. 358.

20. Корнацкий С. А., Высоцкий В. А., Трушечкин В. Г. Проблемы клонального микроразмножения косточковых культур // Достижения в плодоводстве в Нечерноземной зоне РСФСР: Сб. науч. трудов. М., 1991. С. 104-116.

21. Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур: Методические рекомендации / Под ред. В. Е. Перфильева. 1996. С. 73.

22. Свитайло А. М., Бондаренко П. Е., Шевчук Н. С. Клональное микроразмножение подвоев и сортов плодовых культур // Тезисы докладов Международной конференции «Биология культивируемых клеток и биотехнология 2». Новосибирск, 1988. С. 346.

23. Трушечкин В. Г., Высоцкий В. А., Корнацкий С. А. Клональное микроразмножение косточковых культур в системе производства оздоровленного посадочного материала // Тезисы докладов Международной конференции: Биология культивируемых клеток и биотехнология 2. Новосибирск. 1988. С. 319-320.

24. Hammatt N., Grant N. J. Micropropagation of mature British wild cherry // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1997. Vol. 47. P. 103-110.

25. Джигадло М. И. Использование биотехнологических и биофизических методов в селекции и сорторазведении плодовых и ягодных культур: Автореф. дис. ... канд. сельскохозяйственных наук. Мичуринск, 2003. С. 25.

26. Ruzic D., Saric M., Cerovic R., Culafic I. Relationship between the concentration of macroelements, their uptake and multiplication of cherry rootstock Gisela 5 in vitro // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2000. Vol. 63. P. 9-14.

27. Корнацкий С. А. Особенности клонального микроразмножения сливы в системе оздоровленного посадочного материала: Автореф. дис. ... канд. сельскохозяйственных наук. М., 1991. С. 24.

28. Джигадло М. И., Джигадло Е. Н. Размножение вишни методом верхушечных меристем // Улучшение сортимента и прогрессивные приемы возделывания плодовых и ягодных культур: Сборник. Тула, 1988. С. 65-68.

29. Высоцкий В. А., Олешко Е. В. Совершенствование питательной среды для кло-нального микроразмножения вишни // Агротехника и сортоизучение плодовых культур: Сб. науч. трудов. М., 1985. С. 72-76.

30. Чернец А. М. Влияние минерального питания на интенсивность пролиферации сортов вишни in vitro // Тезисы докладов Международной конференции «Биология культивируемых клеток и биотехнология 2». Новосибирск, 1988. С. 343.

31. Неделчева С., Ганева Д. Размножение in vitro на три вегетативни подложки от рода Prunus // Растен. науки. 1985. Т. 22. № 8. С. 98-104.

32. Boleriola-Lucas C., Millins M. G. Micropropogatiоn of two French prune cultiwars (Prunus domesticaL.) // Agronomie. 1984. Vol. 4. № 5. Р. 473-477.

33. Высоцкий В. А., Олешко Е. В. Использование микропрививок при клональном микроразмножении косточковых культур // Сельскохозяйственная биология. М., 1988. № 4. С. 75-77.

34. Плаксина Т. В. Использование биотехнологии в селекции вишни на Алтае // Мат-лы научно-практической конференции, посвященной 70-летию НИИСС им. М. А. Ли-савенко: Проблемы устойчивого развития садоводства Сибири. Барнаул, 2003. С. 108-110.

35. Высоцкий В. А. Действие некоторых регуляторов роста на изолированные мери-стематические верхушки черной смородины // Плодоводство и ягодоводство нечерноземной полосы: Сборник. М. 1979. Том IX. С. 101-107.

36. ЛутоваЛ. А. Биотехнология высших растений: Учебник. СПб., 2003. С. 227.

37. Высоцкий В. А. О генетической стабильности при клональном микроразмножении плодовых и ягодных культур // Сельскохозяйственная биология. 1995. № 5. С. 57-63.

38. De Klerk G. -J. Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. Regeneration of roots, shoots and embryos: physiological, biochemical and molecular aspects // Biologia Plantarum. Vol. 39. № 1. 1997. Р. 53-66.

39. Tang H., Ren Z., Reustle G., Krczal G. Plant regeneration from leaves of sweet and sour cherry cultivars // Scientia Horticulturae. 2002. Vol. 93. P. 235-244.

40. Bhagwat B., David Lane W. In vitro shoot regeneration from leaves of sweet cherry (Prunus avium) "Lapins" and "Sweetheart // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Netherlands. 2004. Vol. 78. P. 173-181.

41. Gentile A., Monticelli S., Damiano C. Adventitious shoot regeneration in peach // Plant Cell Reports. 2002. Vol. 20. P. 1011-1016.

42. Takashina T., Nakano H., Kato R. Efficient plant regeneration culture from leaf explants of in vitro-grown sweet cherry // Acta Horticulturae: XXVI International Horticultural Congress: Genetics and Breeding of Tree Fruits and Nuts. Р. 622.

43. Burgos L., Alburquerque N. Ethylene inhibitors and low kanamycin concentrations improve adventitious regeneration from apricot leaves // Plant Cell Reports. 2003. Vol. 21. P. 1167-1174.

44. Hammatt N., Grant N. J. Shoot regeneration from leaves of Prunus serotina Ehrh. (black cherry) and P. avium L. (wild cherry) // Plant Cell Reports. 1998. Vol. 17. P. 526-530.

45. Grant Neil J., Hammatt Neil. Adventitious shoot development from wild cherry (Prunus avium L.) leaves // New Forests. Netherlands. 2000. Vol. 20. P. 287-295.

46. James D. E., Pоssеу A. J., Ma1hоtrо S. B. Organogenesis in callus derived from stem and leaf tissues of apple and cherry rootstocks // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1984. Vol. 3. № 4.

47. Тюленев В. М., Нафталиев Н. М., Осипова Л. В., Расторгуев С. Л. Клональное микроразмножение ценных генотипов плодовых культур // Тезисы докладов Международной конференции «Биология культивируемых клеток и биотехнология 2». Новосибирск, 1988. С. 320.

48. Jones O. P., Jacqueline A. Gayner and Watkins R. Plant regeneration from callus tissue cultures of the cherry rootstook Colt (Prunus avium x P. pseudocerasus) and the apple root-stook M. 25 (Malus pumila) // The Journal of Horticultural Science. England. 1984. Vol. 59. № 4. P. 463-467.

49. Tang Haoru, Ren Zhenglong, Krczal Gabi. Somatic embryogenesis and organogenesis from immature embryo cotyledons of three sour cherry cultivars (Prunus cerasus L.) // Scientia Horticulturae. 2000. Vol. 83. P. 109-126.

V. Rogovaia, M. Gvozdev

IN VITRO CLONAL MICROPROPAGATION OF STONE-FRUIT CULTURES

The review is focused on principal stages and methods of in vitro clonal micropropagation of stone-fruit cultures. Special emphasis is laid on auxiliary bud propagation technique and method of adventitious shoot regeneration from leaf explants of sour cherry, cherry, peach and apricot. Some aspects ofplant material testing for virus infections have been reviewed as well as certain problems of genetic stability preservation depending on propagation model.

Клетки стареют не только in vivo, но и in vitro. Более того, в условиях in vitro особенно отчётливо проявляется роль гипероксии – естественного и, по-видимому, единственного в этих условиях фактора их старения.
1.8.1. Как известно, выращивание клеток вне организма проводится в специальных сосудах (флаконах) при атмосферном давлении и, следовательно, при рО2, значительно превосходящем значения, которые устанавливаются в организме в норме. Обычно в инкубационной жидкости рО2 близко к рО2 воздуха. Молекулы О2 через тонкий слой питательной среды во флаконе свободно диффундируют к клеткам и внутри них устанавливается высокое рО2, невозможное in vivo или, во всяком случае, превышающее допустимые значения.
С точки зрения кислородно-перекисной концепции старения, условия in vitro представляются более чем подходящими для изучения процесса старения клеток, так как в этих условиях он протекает интенсивнее, в ускоренном темпе и, что очень важно, в «чистом» виде, т.е. при полном отсутствии какого-либо влияния систем организма, которое имеет место при старении in vivo. Данное обстоятельство сразу ставит многие теории старения в разряд второстепенных или сугубо умозрительных, поскольку возрастные изменения происходят или могут происходить и без реализации постулируемых в них положений. Придание нами столь важного значения феномену старения клеток in vitro связано с тем, что именно в этих «простых» условиях можно будет скорее и с меньшими трудностями познать физико-химические основы старения и сущность биологии этого процесса вообще.
В настоящее время, однако, не существует единого мнения по поводу общности причин и механизмов старения клеточных культур и старения клеток в составе многоклеточного организма, о чем свидетельствуют противоположные точки зрения в литературе (Капитанов, 1986). Канунго (Kanungo, 1982), например, хотя и считает, что причина старения организма состоит в старении его клеток, вместе с тем полагает: «условия in vitro не соответствуют физиологическим и свойства клеток могут оказаться измененными. Если исследования in vitro и дают некоторую полезную информацию о самой клетке, то они имеют ограниченную ценность, когда речь идёт о старении организма в целом». С приведенным высказыванием можно согласиться лишь отчасти. Действительно, старение клеток in vitro не может отразить весь сложный спектр возрастных изменений, происходящих в целостном организме на всех уровнях и, к тому же, в немалой степени определяемых системой различных связей в нем, в том числе обратных. Применительно к условиям in vitro теряет смысл ряд принципов старения, проявляющихся на организменном уровне (см. п. 1.1.2), но некоторые из них продолжают действовать и в клеточных культурах. Таковы, в частности, многоочаговость процесса старения, т.е. развитие повреждений в различных частях клетки или в различных ее молекулярных циклах, и гетерохронность старения среди клеток одного культивируемого типа. Кроме того, в этих условиях принципы необратимости, нерегулируемости и непрерывности старения клеток должны, очевидно, проявляться более явственно.
Указанные выше недостатки при изучении старения клеток вне организма не представляются принципиальными, если иметь в виду, что одна из основных задач геронтологии состоит в установлении главного первичного фактора ок-ружающей среды, предопределяющего старение всех живых организмов. Таким фактором, как мы полагаем, является гипероксия в земной атмосфере, поэтому жизнь клеток в условиях in vitro можно считать удобной экспериментальной моделью для изучения действия именно указанного физического фактора на их старение. Обычное 18-21 %-ное содержание О2 в воздухе и соответственно высокие уровни дисбаланса Δ (ПО – АО) и пероксигеназных процессов оказывают угнетающее действие на субклеточные элементы, на нормальные физиологические и метаболические процессы. В результате последние постепенно затухают, и большинство клеток погибает вследствие окислительного цитолиза или по кислородно-перекисному механизму апоптоза (см. п. 7.1).
Фактов, указывающих на ведущую роль избыточных рО2, АФК и ПОЛ в снижении выживаемости клеток в условиях in vitro и протекторного действия различных антиоксидантных факторов, более, чем достаточно (Branton et al., 1998; Drukarch et al., 1998; Heppner et al., 1998). К числу последних отнесен недавно и L-карнозин. Добавление физиологических концентраций его к стандартным средам увеличивает продолжительность жизни фибробластов челове-ка in vitro и замедляет процессы физиологического старения в них. Длительно пассируемые на обычных средах клетки после переноса их в карнозин-содер-жащую среду проявляли омолаживающий эффект. Оптический же изомер D-карнозин не обладал указанными свойствами (Холлидей, МакФарланд, 2000) В то же время в ходе длительного культивирования определённый процент клеток не только не деградирует, но и, адаптируясь к токсическим окислительным условиям, «добивается» того, что внутриклеточный параметр Δ (ПО – АО) не повышается до высоких значений ΔА2 или ΔЦ, но может остановиться на несколько меньшем уровне ΔК, необходимом для их злокачественной трансформации. Случаи «спонтанной» малигнизации клеток в культуре и возможный ее механизм обсуждаются нами отдельно в главе 4.
1.8.2. Приведенные выше соображения можно считать частью наших теоретических положений о причинах и следствиях старения клеток in vitro. Для подтверждения и развития этих положений естественно привлечь некоторые уже известные факты, содержание и смысл которых легко могут быть «вписаны» в кислородно-перекисную концепцию старения клеток. Начнем с того, что вышеописанные обычные условия культивирования клеток, являющиеся для них токсическими, могут быть смягчены путем искусственного снижения концентрации О2 в газовой среде. При этом угнетающее действие гипероксии и скорость старения клеток должны снизиться. Следует также иметь в виду, что такая известная биологическая константа, как лимит Хейфлика, в действительности оказалась переменной величиной, зависящей от содержания О2 в газовой среде, причем в условиях оксидативного стресса этот лимит уменьшается, а при снижении рО2, напротив, возрастает (Chen et al., 1995).
Действительно, пребывание культуры фибробластов в атмосфере с пониженным содержанием О2 (10 %) удлиняет срок их жизни на 20-30 %. То же происходит и с клетками легких человека и мышей (Packer, Walton, 1977). Период пролиферативной жизнеспособности диплоидных фибробластов IMR90 человека с различными исходными уровнями удвоения популяции увеличива-ется при снижении содержания О2 в среде до 1,6 или 12 %. Этот период при 1 % О2 возрастает на 22 %, а возвращение культур из среды с 1 % О2 в среду с 20 % О2 быстро развивает их старение. В культуре диплоидных фибробластов от больного синдромом Вернера (раннее старение) продолжительность репликативной жизнеспособности также возрастает при снижении рО2 (Saito et al., 1995). Замедление старения культивируемых хондроцитов куриного эмбриона показано при 8 %-ном содержании О2 в атмосфере по сравнению с контролем (18 %), причём опытные клетки дольше сохраняли признаки «молодых», имели более высокую скорость пролиферации (Nevo et al., 1988). Под влиянием различных антиоксидантов скорость пролиферации клеточных культур также уве-личивается, а старение их замедляется (Packer, Walton, 1977; Обухова, 1986), что подтверждает уже сказанное выше: явно избыточное действие оксидантов подавляет пролиферацию клеток и обусловливает ускоренное их старение.
В экспериментах с клеточными культурами сравнительно легко проверить также действие О2-зависимого механизма регуляции количества дыхательных ферментов (Murphy et al., 1984; Suzuki et al., 1998) и митохондрий (Озернюк, 1978). Согласно этому механизму, при плавном и медленном возрастании уро-вня гипероксии содержание таких ферментов и число митохондрий должны постепенно нарастать, а при гипоксии, наоборот, – падать. Действительно, при выращивании культуры фибробластов на среде с пониженным содержанием О2 концентрация цитохромов значительно снижается (Pius, 1970). Здесь, безусловно, задействован объективный процесс адаптации дыхательной системы к внутриклеточному уровню рО2. Однако в данном феномене не меньшее значение имеет скорость адаптации, от которой будет зависеть и интенсивность старения культивируемых клеток. Кажется очевидным, что в процессе биологической эволюции многоклеточный организм приспосабливался к постепенному нарастанию рО2 в земной атмосфере также постепенно. При этом внутри клеток самым эффективным можно считать «митохондриальный» механизм адаптации: количество ферментов дыхательной цепи и самих митохондрий варьируется самоорганизующейся системой так, чтобы оно обеспечивало целостность и относительно нормальное функционирование клеток при изменениях внутриклеточного рО2 в определённых эволюционно апробированных уже пределах.
Совсем иная ситуация складывается при быстром перенесении клеток из живого организма в условия in vitro. Резкий перевод их в состояние гипероксии равносилен нанесению им значительного скачкообразного возмущающего воз-действия, к которому они, вообще говоря, не подготовлены. Как же реагирует первичная клеточная культура на такое возмущение? По-видимому, на протяжении определенного начального периода культуральная среда является для клеток «стрессовой», а состояние самих клеток в этот период – шоковым. Затем какое-то время затрачивается на подготовку и проведение возможных в этих экстремальных условиях адаптивных «мероприятий» антиоксидантного характера. Вероятно, за счёт последних на первых порах удается не только избежать окислительной деградации, но и создать условия для стимуляции пролиферативного процесса, снизив высокий вначале явно «цитотоксический» внутриклеточный дисбаланс ΔЦ (ПО – АО) до необходимого для окислительного митогенеза. Однако и эта стадия в жизни первичной культуры не может не ограничиваться непрерывно угнетающей ее гипероксической средой. В данной ситуации начинает инактивироваться сам адаптивный механизм, соответственно снижается наращивание антиоксидантной системы, а в последующем про-исходит и регрессия последней. При высоком уровне ПОЛ, прежде всего, повреждаются митохондрии (см. п. 1.3), количество которых продолжало бы возрастать как приспособительный акт в случае постепенного повышения рО2 в газовой среде.
Неспособность адаптивных механизмов клетки к быстрой и полной нейтрализации внезапно возникшей гипероксии, с одной стороны, и высокая уязвимость митохондриального звена при пероксидативных стрессах, с другой, определяют необратимый процесс дегенерации клеток после возникновения в них «критического уровня» повреждений. Важно здесь ещё раз отметить: деструктивные изменения именно в митохондриях как основных потребителей О2 и в этом смысле как главной, антикислородной ступени защиты в антиоксидантной системе клетки не оставляют надежд на выживание для большинства клеток в жестких условиях in vitro, поскольку в этом случае расстраивается сам адап-тивный механизм снижения внутриклеточного рО2 и уровня ПОЛ. Приведенные соображения полностью согласуются с первичной ролью изменений митохон-дрий в инициации механизма старения, постулированной, правда, примени-тельно к культивируемым in vitro фибробластам (Kanungo, 1980).
Пероксидативный стресс и токсический эффект в условиях in vitro могут быть ещё более усилены, если в культуральную среду ввести катализаторы ПОЛ, например ионы Fe2+ или Cu2+. Действительно, добавление в среду культивирования сульфата меди в концентрации 60 мг/л приводило к достоверному снижению средней продолжительности жизни коловраток на 9 %, а также к существенно более заметному, чем в контроле, нарастанию количества MDA. Авторы этого эксперимента (Enesco et al., 1989) логично полагают, что сокра-щение продолжительности жизни происходит вследствие ускорения ионами меди процессов генерации свободных радикалов. Указанная концентрация сульфата меди оказалась оптимальной, так как бoльшие (90 и 180 мг/л) были слишком токсичными для коловраток, а меньшая (30 мг/л) – малоэффективной.
Таким образом, необратимые ускоренные старение и окислительная деградация клеток при резкой смене среды обитания с in vivo на in vitro являются следствием недостаточной готовности их без серьезных негативных последствий воспринять столь крутое усиление кислородного воздействия. Если такой резкий перевод в новые условия заменить «мягким», например, многоступенчатым и растянутым во времени, то можно ожидать, что присущая клеткам способность адаптироваться к постепенно нарастающей гипероксии в этом случае реализуется в полной мере. Более того, в принципе таким способом можно добиться адаптации клеток не только к обычному 18-21 %-ному уровню О2 в атмосфере, но и к существенно превышающим его искусственно создаваемым гипероксическим средам. В подтверждение сказанному сошлемся на весьма убедительные факты, полученные Велком с соавт. (Valk et al., 1985). В результате постепенной адаптации к возрастающей концентрации О2 ими получена линия клеток яичника китайского хомячка, устойчивая к высокому содержанию О2 и способная пролиферировать даже при 99 % О2 в атмосфере. К столь значительной гипероксии и зависимым от нее процессам оказались адаптированными все ступени защиты – антикислородная, антирадикальная и антиперекисная (подробнее об этих результатах см. в главе 4).
1.8.3. Изложенные соображения об особенностях изменения прооксидан-тно-антиоксидантного дисбаланса в культивируемых клетках как основного действующего фактора их старения и трансформации можно условно представить графически (см. рис. 11). На кривой 1, отражающей указанные изменения при быстром перемещении клеток в среду in vitro, выделены три последо-вательные во времени этапа, которые, похоже, соответствуют известным в литературе адаптационной (латентной) фазе, фазе логарифмического роста и стационарной фазе. При этом старение клеточных культур обычно связывается с процессами в стационарной фазе, где со временем они претерпевают различные изменения, сходные с наблюдающимися в клетках в составе стареющего организма (Капитанов, 1986; Хохлов, 1988). В частности, при старении клеток in vitro изменяются ферменты, происходит их анэу- и полиплоидизация (Re-macle, 1989). Как и клетки in vivo, культивируемые клетки по мере старения накапливают липофусциновые гранулы (Обухова, Эмануэль, 1984), указывая на очевидное протекание перекисных процессов и окислительные нарушения в структуре липидов и белков. Эти и ряд других фактов так или иначе могут быть согласованы с гипотезой о кислородно-перекисном (свободнорадикальном) ме-ханизме старения. Более же всего, в пользу такого механизма свидетельствуют данные о том, что при повышении концентрации антиоксидантов продолжительность жизни клеток in vitro больше, а при понижении – меньше, чем в контроле. Такие результаты получены, например, при изменении содержания GSH в фибробластах человека (Shuji, Matsuo, 1988), каталазы и SOD – в куль-тивируемых нейронах (Drukarch et al., 1998).
Что касается пологих и тносительно плавно возрастающих кривых 2 на рис. 11, то такой характер их объясняется тем, что за каждым небольшим искусственно создаваемым приращением прооксидантной составляющей дисбаланса Δ (ПО – АО) в клетке следует с некоторым запаздыванием соответствующее адаптивное приращение в ней антиоксидантной компоненты. Многократ-ное повторение этой акции и обеспечивает приспособление и выживаемость клеток при постепенном, ступенчатом повышении уровня гипероксии.
В обоих указанных случаях обратим внимание на варианты, ведущие к так называемой «спонтанной» малигнизации клеток (см. главу 4). Этот феномен, с нашей точки зрения, может реализовываться лишь в тех клетках, где дисбаланс достигает значений ΔК, устойчиво удовлетворяющих неравенству (см. п.1.1.2)
ΔП (ПО – АО) а точнее, с учетом «апоптозных» дисбалансов, – соотношению (см. п. 7.1.1)
ΔА1 (ПО – АО) С помощью подобных процедур, в конечном счете, формируются перевивные линии трансформированных и опухолевых клеток, способных к длительному существованию вне организма. В контексте же рассматриваемых нами проблем более важно определиться с подходом к исследованию взаимосвязи старения и канцерогенеза. Один из них, а именно изучение самого процесса появления опухолевых клеток в ходе старения нормальных клеточных культур (Witten, 1986), представляется наиболее естественным и потому предпочтительным

подходом. При установлении дисбаланса Δ (ПО – АО) в промежутке между ΔК и ΔЦ клетки могут подвергаться апоптозу типа А2 (см. п. 7.1.1).
Согласно теломерной теории, репликативное старение клеток, в том числе и в условиях in vitro, связано с укорочением теломер после каждого митоза, вплоть до некоторой минимальной длины, результатом чего является утрата такими клетками способности к делению (см. п. 1.4.3 и 1.4.4). Анализ известной литературы по этому вопросу показывает, что данный постулат в некоторых случаях не подтверждается. Примером тому служат исследования Кармана и соавт. (Carman et al., 1998), проведенные на диплоидных эмбриональных кле-тках сирийского хомячка (SHE). Эти клетки после 20-30 циклов удвоения прекращали пролиферацию, теряли способность вступать в S-фазу после стимуляции сывороткой. В то же время клетки SHE экспрессировали теломеразу в течение всего репликативного жизненного цикла, а средний размер теломер не уменьшался. Выходит, что in vitro клетки могут иногда стареть по механизмам, не связанным с потерей теломер.
Как представляется нам, в указанном случае свои коррективы вносят условия гипероксии в среде культивирования. Если в состоянии умеренно повышенного уровня АФК и пероксидация выполняют нередко позитивные функции, активируя отдельные этапы прохождения митогенного сигнала, реплика-ции, транскрипции и иных процессов (об этом говорилось в ряде предыдущих параграфов и упоминается в некоторых последующих), то в случае интенсивного окислительного стресса неизбежны и негативные последствия. Например, часть макромолекул, в том числе участвующих в митогенезе, может быть модифицирована, что, независимо от активности теломеразы и длины теломер, дол-жно ингибировать пролиферацию и/или индуцировать какие-то другие нарушения, вплоть до приводящих к гибели клеток.
Как бы там ни было, две причины старения клеток in vitro – накопление ошибок в условиях содержания их в культуре и укорочение теломер – остаются все же наиболее вероятными. Полагают, что в обоих случаях активируются системы белков р53 и Rb, а при нарушении их функции происходит трансформация клеток (Sherr, DePinho, 2000). В более общем плане нам видится следующее: в токсических гипероксических условиях культивирования норма-льные клетки, старея, претерпевают, скорее всего, апоптоз А1, а опухолевые клетки – апоптоз А2. В случае неполадок в механизме апоптоза первые подвергаются неопластической трансформации, вторые же – окислительному цитолизу (см. п. 7.1.1).
Дополнительной причиной, способствующей усилению процессов окислительной деструкции в клетках in vitro, может считаться и тепло, как постоянно действующий фактор окружающей среды. Действительно, с помощью высоко-чувствительного метода (описание его приводят авторы Брусков и др., 2001) было показано, что под действием тепла в водных растворах генерируются АФК. В результате тепловой активации растворенного в воде атмосферного О2 протекает последовательность реакций
О2 → 1О2 → О → НО2˙ → Н2О2 → ОН˙.
Образующиеся АФК, по-видимому, и содействуют тепловому повреждению ДНК и других биологических молекул путём их «автоокисления».
Наконец, отметим еще один способ интенсификации процесса старения клеток в условиях in vitro с помощью процедуры аноксии – реоксигенации, результаты которой, по нашему мнению, наиболее выражено отражают суть кислородно-перекисной модели старения. Основу механизма старения в данном случае составляют два принципиальных эффекта: адаптивное сокращение (ослабление) митохондриальной базы в период аноксии или гипоксии (см. выше); значительное усиление ПОЛ и других процессов окислительной деструкции при последующей реоксигенации вследствие резкого повышения рО2 (относительно состояния аноксии) и невозможности быстрой утилизации избыточного О2 «аноксическими» митохондриями. Степень пероксидативного стресса и, сле-довательно, скорость старения клеток будут зависеть от длительности пребывания их в состоянии аноксии: чем продолжительнее этот период, тем лучше сможет адаптироваться митохондриальная база к низкому уровню рО2 и тем значительнее будет урон клеток после устранения ишемии.
Примером реализации старения клеток по указанному «сценарию» может служить следующий факт. Гепатоциты, выделенные у крыс разного возраста, подвергали 2-часовой аноксии и 1-часовой реоксигенации. Установлено, что в реоксигенационной фазе гепатоциты продуцируют большое количество кислородных радикалов, ответственных за повреждение их мембран и за другие при-частные к старению структурно-функциональные изменения, причем старые клетки были чувствительнее к реперфузионной травме (Gasbarrini et al., 1998). Подобного рода факты рассматриваются нами и в главе 4 в связи с обсужде-нием механизма старения и «спонтанной» малигнизации клеток в культуре.

19713 0

Любая ткань растений - это сообщество клеток, и если она изолирована (выделена) из целого организма, то лишена его регулирующего воздействия и питания. Следовательно, одним из принципов метода культуры тканей (клеток) является воспроизведение in vitro условий, близких или идентичных тем, в которых клетки находятся на материнском растении, для обеспечения их полноценного питания и развития.

Тогда при строгом соблюдении этих условий в культуре тканей размножаются (регенерируют) идентичные исходному генотипу клетки и растения. Это одно из направлений использования. Однако если такие условия достигаются и воспроизводятся не в полной мере, то клетка оказывается в относительно иных физико-химических условиях, что приводит к временному и качественному изменению в реализации ее генетической информации.

Смещая в эксперименте временную реализацию генетической информации (с помощью гормональных воздействий), можно наблюдать ее модификацию, а под влиянием различных экстремальных трансформирующих факторов возможно ее изменение в нужном направлении. Клетка в условиях культуры in vitro проявляет цитогенетическую неустойчивость, в результате этого возникают клетки с генетической гетерогенностью, появляются мутанты с измененным морфогенезом, которые могут быть исходным материалом для селекции.

Состав питательных сред и роль их отдельных компонентов

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям неорганические элементы: макроэлементы в миллимолярных концентрациях (азот, фосфор, калий, кальций, магний, сера), микроэлементы - в микромолярных (железо, бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также органические элементы: витамины, углеводы, аминокислоты и другие (например, гидролизат казеина, мезоинозит и др.).

В зависимости от консистенции существует деление на жидкие и твердые питательные среды.

Для приготовления твердых питательные сред используют агар-агар (0,7-1 %), который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. Обычная его концентрация - 8-10 г на литр среды. Агар обеспечивает диффузию питательных элементов из среды в культивируемые ткани. Вместо агара можно использовать биогели.

Необходимо учитывать, что клетки растений и отдельные компоненты среды (витамины, фитогормоны, агар) чувствительны к определенным концентрациям водородных ионов. Например, агар в кислой среде теряет способность образовывать гель. В зависимости от объектов культивирования рН среды может варьировать от 5,2 до 6,6.

Неорганические элементы. Для роста растений в первую очередь необходимы углерод, кислород и водород. Если кислород и водород присутствуют в воздухе, то источником углерода для культуры изолированных тканей являются органические соединения. Но кроме этого для обеспечения полноценного метаболизма и его регуляции в изолированной культуре необходим ряд макро- и микроэлементов неорганического происхождения.

Макроэлементы присутствуют в среде в концентрациях порядка 10 М. Наиболее значимы из них азот, фосфор, натрий, калий, магний, кальций и сера.

Микроэлементы составляют в среде концентрации 10-6 М. Присутствие их обязательно при культивировании ткани в жидкой среде. По некоторым данным, отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 % в первом пассаже и приводит культуру к гибели в течение двух следующих пересадок. На агаризованой среде растения не так остро реагируют на отсутствие микроэлементов, так как в агаре содержатся многие микро- и некоторые макроэлементы.

Наиболее важными микроэлементами являются железо и медь, потому что они участвуют в регуляторных процессах и окислительно-восстановительных превращениях, входят в состав важных коферментов. Далее следуют марганец, цинк, молибден, кобальт и бор.

Органические составляющие сред. Согласно многочисленным данным, хорошим источником азота является мочевина, особенно для тканей подсолнечника, табака, топинамбура и др.

В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют аминокислоты (а-аланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспарагиновую кислоту) или гидролизат казеина - источник аминокислот.

В культуре изолированных тканей растений действие аминокислот значительно варьирует для разных тканей и разных физиологических состояний вводимых в культуру эксплантов. Полностью заменить нитраты как источник азота способны аланин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, гликокол, аспарагин, пролин.

Формы аминокислот также по-разному влияют на рост: D-формы -токсичны, L-формы - пригодны. Аминокислоты, внесенные в питательную среду в дополнение к нитратам, могут оказывать стимулирующее, угнетающее и формативное действие на рост культуры тканей. Это зависит как от самой аминокислоты, так и от ее содержания в среде.

Очень часто исследователи заменяют смесь аминокислот гидрлизатом казеина. Последний способен увеличивать содержание никотина в культурах табака и подавлять биосинтез липидов во многих каллусных и суспензионных культурах.

Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений, так как в большинстве случаев последние неспособны к автотрофному питанию.

Культуры тканей, даже зеленеющие на свету, не автотрофны в отношении углеводного питания. При изолировании и помещении на питательную среду кусочков хлорофиллоносных тканей они, как правило, теряют хлорофилл.

При выращивании на свету одни ткани остаются лишенными хлорофилла (галловая опухоль партеноциссуса, ткани сердцевинной паренхимы табака и др.). Другие ткани зеленеют на свету, но не способны обеспечивать себя полностью углеводами за счет фотосинтеза, и их необходимо выращивать на питательной средах, содержащих сахар.

При помещении кусочка ткани, изолированного из растения, на питательную среду без сахара его содержание в ткани начинает уменьшаться.

Трата сахаров зависит от сезонных изменений в самой ткани (ткани, взятые весной, теряют сахаров больше) и от содержания ауксинов в среде. При образовании каллуса старая ткань быстро теряет сахара, а в новообразующейся их количество возрастает. При помещении ткани на питательную среду, снабженную сахаром, ткани поглощают и трансформируют сахара. Количество поглощенного сахара и в особенности его превращения в другие формы зависят как от источника сахаров в среде, так и от типа ткани.

Наилучшим источником углеродного питания для большинства тканей является сахароза, обычно применяемая концентрация ее в питательной среде составляет 2-5 %. Чаще всего в качестве углеводов используют сахарозу в концентрации 3 %. Помимо сахарозы в качестве источника углеродного питания можно использовать глюкозу, фруктозу, галактозу и др. После сахарозы наиболее употребляемым источником углеродного питания для культивирования тканей растений является глюкоза. Из 33 исследованных культур (травянистых и древесных) 85 % имели отличный и хороший рост на среде с глюкозой.

На третьем месте по эффективности использования культурами тканей растений стоит фруктоза. Ее успешно используют для своего роста 2/3 культур фруктозу. Галактоза заметно отличается от глюкозы и фруктозы по действию на рост изолированных тканей растений. Более половины изученных культур почти не используют галактозу для роста. Однако есть данные, отмечающие положительную роль галактозы для культивирования тканей и органов растений.

В отличие от изолированных корней, которые могут расти только на среде с сахарозой, другие ткани, обладающие активными гидролитическими ферментами, могут использовать для питания самые разнообразные сахара и полисахариды. Способность ткани усваивать те или иные сахара зависит от ее происхождения. Перенос ткани с более бедной сахаром среды на более богатую обычно не вызывает нежелательных явлений, обратный перенос приводит к некрозам тканей.

Основное действие сахарозы состоит в увеличении уровня образования метаболитов, использование исходно повышенных концентраций сахарозы обычно приводит к росту выхода вторичных метаболитов в культурах. Влияние изначально высоких концентраций сахарозы, вероятно, состоит в увеличении осмотического потенциала среды.
Необходимо отметить влияние условий стерилизации на действие сахаров. При автоклавировании сахароза дает следы глюкозы и фруктозы, а в среде с сахарозой, которая не подверглась специальной очистке, наблюдается образование веществ, стимулирующих рост тканей.

Выращивание хлорофиллоносных и лишенных хлорофилла тканей на свету или в темноте изменяет как содержание растворимых сахаров в ткани, так и соотношение разных их групп. Различия в спектральном составе света также сказываются на углеводном метаболизме тканей.

Витамины принадлежат к активным веществам, играющим существенную роль в культуре тканей. Известно, что в процессе роста растения синтезируют необходимое им количество витаминов. Несмотря на это, исследования показывают, что при внесении витаминов в питательную среду рост ткани улучшается. Большая часть витаминов входит в состав ферментов, катализирующих многие метаболически важные реакции. Витамины делятся на водорастворимые и жирорастворимые.

В состав сред чаще всего включают водорастворимые витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, аскорбиновую кислоту. При внесении полной смеси витаминов стимулирующее действие может определяться синергизмом между отдельными витаминами. По наблюдениям Хендерсона, смесь витаминов наиболее активна после слабого роста ткани в предыдущем пассаже.

Действие витаминов на рост культуры тканей зависит от способности ткани синтезировать их в оптимальном или субоптимальном количестве и от состава других компонентов питательной смеси, с которыми витамины могут взаимодействовать синергически или антагонистически. Интересно, что клеточная суспензия, полученная путем помещения ткани в жидкую среду, при пассировании значительно более чувствительна к недостатку витаминов, чем сама ткань. Исключение из среды холина и аскорбиновой кислоты приводит к увеличению одиночных суспендированных клеток. Следует отметить, что в каждом конкретном случае место отдельного витамина в сложной цепи метаболизма различно.

Клетки растений и животных более чувствительны, чем микроорганизмы, к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически чистых компонентов среды.

Вместе с тем некоторые питательные среды содержат натуральные биологические добавки: жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана, картофельный отвар и др. Они являются поставщиками более сбалансированных питательных компонентов по сравнению с искусственными средами.

В целях предотвращения возможного бактериального и грибного загрязнения в среды добавляют иногда такие антибиотики, как полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, левомицитин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат), рифамгащин и др. Большинство антибиотиков неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стерилизуют фильтрацией через мембраны.

Наличие макро- и микроэлементов в составе культуральных сред определяется потребностями объектов культивирования. Широко применяемые в настоящее время среды Гамборга В5 и Мурасиге и Скуга (МС) (табл. 4.1, табл. 4.2) содержат по сравнению со средами Уайта значительно большие количества калия, фосфора и микроэлементов.

Таблица 4.1. Примеры составов наиболее употребляемых питательных сред для культивирования растительных клеток тканей

В настоящее время существует большое количество различных прописей питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток. Их состав зависит от задач культивирования, видов растений и типов эксплантов. Наиболее часто используемая среда Мурасиге и Скуга, впервые была составлена и предложена в 1962 г. Кроме того, в настоящее время широко известны среды Уайта, Нича, В5, N6 и др. (табл. 4.1), отличающиеся набором отдельных составляющих компонентов и их соотношением. Существуют и коммерческие препараты питательных сред, выпускаемые иностранными и российскими фирмами.

Таблица 4.2. Состав среды Мурасиге-Скуга

МС - самая универсальная среда, пригодная для образования и роста каллуса, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Среда Гамборга и Эвелега применима для бобовых растений и злаков. Среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации. Среда Нича рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыльников.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова