Любая каталитическая реакция предполагает изменение скоростей как прямой, так и обратной реакции за счет снижения ее энергетики. Если хими­ческая реакция протекает с выделением энергии, то она должна начинаться спонтанно. Однако этого не происходит, потому что компоненты реакции должны быть переведены в активированное (переходное) состояние. Энергия, необходимая для перевода реагирующих молекул в активированное состояние, называется энергией активации . Переходное состояние характери­зуется непрерывным образованием и разрывом химических связей, причем между переходным и основным состояниями существует термодинамическое равновесие. Скорость прямой реакции зависит от температуры и разности значений свободной энергии для субстрата в переходном и основном состоя­ниях. Эта разность называется свободной энергией реакции.

Достижение переходного состояния субстрата возможно двумя путями: за счет передачи реагирующим молекулам избыточ­ной энергии (например, за счет увеличе­ния температуры) или снижения энергии активации соответствующей химической реакции (рисунок 2.8).

Ферменты «помогают» субстратам принять переходное состояние за счет энергии связывания при образовании фермент-субстратного комплекса. Сни­жение энергии активации при фермента­тивном катализе обусловлено увеличе­нием числа стадий химического процес­са. Индуцирование ряда промежуточных реакций приводит к тому, что исходный активационный барьер дробится на несколько более низких барьеров, преодо­леть которые реагирующие молекулы могут гораздо быстрее, чем основной.

Механизм ферментативной реакции можно представить следу­ющим образом:

1) соединение фермента (Е) и субстрата (S) с образованием не­стойкого фермент-субстратного комплекса (ES): Е + S ® E-S;

2) образование активированного переходного состояния: Е-S ® (ES)*;

3) высвобождение продуктов реакции (Р) и регенерация фермен­та (Е): (ES)* ® Р + Е.

Для объяснения высокой эффективности действия энзимов было предложено несколько теорий механизма ферментативного катализа. Наиболее ранней является теория Э. Фишера (теория «шаблона» или «жесткой матрицы»). Согласно этой теории фермент является жест­кой структурой, активный центр которой представляет собой «сле­пок» субстрата. Если субстрат подойдет к активному центру фермен­та как «ключ к замку», то произойдет химическая реакция. Эта тео­рия хорошо объясняет два типа субстратной специфичности фермен­тов - абсолютную и стереоспецифичность, но оказывается несостоя­тельной при объяснении групповой (относительной) специфичности ферментов.

Теория «дыбы» основана на представлениях Г. К. Эйлера, изучав­шего действие гидролитических ферментов. По этой теории фермент связывается с молекулой субстрата в двух точках, при этом происходит растяжение химической связи, перераспределение элек­тронной плотности и разрыв химической связи, сопровождающий­ся присоединением воды. Субстрат до присоединения к ферменту имеет «расслабленную» конфигурацию. После связывания с активным центром молекула субстрата подвергается растяжению и деформации (располагается в активном центре как на дыбе). Чем больше длина химических связей в субстрате, тем легче они разрываются и тем меньше энергия активации химической реакции.

В последнее время нашла широкое распространение теория «ин­дуцированного соответствия» Д. Кошланда, которая допускает высо­кую конформационную лабильность молекулы фермента, гибкость и подвижность активного центра. Субстрат индуцирует конформационные изменения молекулы фермента таким образом, что активный центр принимает необходимую для связывания субстрата простран­ственную ориентацию, т. е. субстрат подходит к активному центру как «рука к перчатке».

Согласно теории индуцированного соответствия механизм взаи­модействия фермента и субстрата следующий:

1. фермент по принципу комплементарности распознает и «ловит» молекулу субстрата. В этом процессе белковой молекуле помога­ет тепловое движение ее атомов;

2. аминокислотные остатки активного центра смещаются и под­страиваются по отношению к субстрату;

3. химические группировки ковалентно присоединяются в активном центре - ковалентный катализ .

Кинетика ферментативных реакций. Кинетика изучает скорости, механизмы реакций и влияние на них таких факторов, как концентрации ферментов и субстратов, темпера­тура, рН среды, присутствие ингибиторов или активаторов.

При постоянной концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента (рисунок 2.9, а). График зависимости скорости ферментативной реакции от кон­центрации субстрата имеет вид равнобочной гиперболы (рисунок 2.9, б).

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса - Ментен:

,

где V - стационарная скорость биохимической реакции; V max - максимальная скорость; К m - константа Михаэлиса; [S] - концен­трация субстрата.

а

б

Рисунок 2.9 - Зависимость скорости ферментативной реакции от

концентрации фермента (а) и субстрата (б)

Если концентрация субстрата низкая, т. е. [S] << К m , то [S] в знаменателе можно пренебречь.

Таким образом, при низких концентраци­ях субстрата скорость реакции прямо пропор­циональна концентрации субстрата и описы­вается уравнением первого порядка. Это со­ответствует начальному прямолинейному уча­стку кривой V = f [S] (рисунок 2.9, б).

При высоких концентрациях субстрата [S] >> К m , когда К m можно пренебречь, уравнение Михаэлиса - Ментен приобретает вид

Т.е. V=V max .

Таким образом, при высоких концентрациях субстрата скорость реакции стано­вится максимальной и описывается уравнением нулевого порядка. Это соответствует участку кривой V =f [S], параллельному оси абсцисс.

При концентрациях субстрата, численно сравнимых с констан­той Михаэлиса, скорость реакции возрастает постепенно. Это вполне согласуется с представлениями о механизме ферментативной реак­ции:

S + Е ES Р + Е

где S - субстрат; Е - фермент; ES - фермент-субстратный комп­лекс; Р - продукт; k 1 - константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k 2 - константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с образованием исходных реагентов; k 3 - константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с обра­зованием продукта.

Скорость превращения субстрата с образованием продукта (Р) про­порциональна концентрации фермент-субстратного комплекса . При малых концентрациях субстрата в растворе имеется некоторое число свободных молекул фермента (Е), не связанных в комплекс (ES). Поэтому при увеличении концентрации субстрата концентрация ком­плексов растет, следовательно, растет и скорость образования продук­та. При больших концентрациях субстрата все молекулы фермента связаны в комплекс ES (явление насыщения фермента), поэтому даль­нейшее повышение концентрации субстрата практически не увеличи­вает концентрацию комплексов и скорость образования продукта остается постоянной.

Таким образом, становится ясен физический смысл максимальной скорости ферментативной реакции . V m ах - это скорость, с которой реагирует фермент, полностью существующий в виде фермент-суб­стратного комплекса.

Константа Михаэлиса численно соответствует такой концентра­ции субстрата, при которой стационарная скорость равна половине максимальной (см. рисунок 2.9, б). Данная константа характеризует кон­станту диссоциации фермент-субстратного комплекса:

Физический смысл константы Михаэлиса в том, что она характе­ризует сродство фермента к субстрату. К m имеет малые значения, когда k 1 >(k 2 + k 3), т.е. процесс образования комплекса ES преоб­ладает над процессами диссоциации ES. Следовательно, чем меньше значения К m , тем сродство фермента к субстрату больше. И, наобо­рот, если К m имеет большое значение, то (k 2 + k 3) > k 1 и процессы диссоциации ES преобладают. В этом случае сродство фермента к субстрату небольшое.

Ингибиторы и активаторы ферментов. Ингибиторами ферментов называются вещества, снижающие активность ферментов. Любые денатурирующие агенты (например, соли тяжелых металлов, кислоты) являются неспецифическими ингибито­рами ферментов.

Обратимые ингибиторы - это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом. Необратимые ингибиторы - это соединения, специфически связывающие функциональные группы активного центра и образующие ковалентные связи с ферментом.

Обратимое ингибирование разделяют на конкурентное и неконку­рентное. Конкурентное ингибирование предполагает структурное сход­ство ингибитора и субстрата. Ингибитор занимает место в активном центре фермента, и значительное количество молекул фермента ока­зывается блокировано. Конкурентное ингибирование можно снять, если повысить концентрацию субстрата. В этом случае субстрат вы­тесняет конкурентный ингибитор из активного центра.

Обратимое ингибирование может быть неконкурентным в отноше­нии субстрата. В этом случае ингибитор не конкурирует за место присоединения к ферменту. Субстрат и ингибитор связываются с раз­ными центрами, поэтому появляется возможность образования комп­лекса IE, а также и тройного комплекса IES, который может распа­даться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комп­лекс ES.

По характеру своего действия ингибиторы подразделяются на спе­цифические и неспецифические.

Специфические ингибиторы оказывают свое действие на фермент, присоединяясь ковалентной связью в активном центре фермента и выключая его из сферы действия.

Неспецифическое ингибирование предполагает воздействие на фер­мент денатурирующих агентов (солей тяжелых металлов, мочевины и др.). В этом случае в результате разрушения четвертичной и третич­ной структуры белка происходит потеря биологической активности фермента.

Активаторы ферментов - это вещества, увеличивающие скорость фермен­тативной реакции. Чаще всего в качестве активаторов выступают ионы метал­лов (Fe 2+ , Fe 3+ , Cu 2+ , Co 2+ , Mn 2+ , Mg 2+ и т.д.). Различают металлы, находящиеся в составе металлоферментов, являющиеся кофакторами, и вы­ступающие в качестве активаторов ферментов. Кофакторы могут прочно связы­ваться с белковой частью фермента, что же касается активаторов, то они легко отделяются от апофермента. Такие металлы являются обязательными участника­ми каталитического акта, определяющими активность фермента. Активаторы уси­ливают каталитическое действие, но их отсутствие не препятствует протека­нию ферментативной реакции. Как правило, металл-кофактор взаимодейству­ет с отрицательно заряженными группировками субстрата. Металл с переменной валентностью принимает участие в обмене электронов между субстратом и ферментом. Кроме того, они принимают участие в образовании ста­бильной переходной конформации фермента, что способствует более быстро­му образованию ES комплекса.

Регуляция активности ферментов. Одним из основных механизмов регуляции метаболизма служит регуляция активности ферментов. Одним из примеров является аллостерическая регуляция, регуляция посредством активаторов и ингибиторов. Часто бывает так, что конечный продукт метаболического пути является ингибитором регуляторного фермента. Такой тип ингибирования называется ретроингибированием , или ингибированием по принципу отрицательной обратной связи.

Многие ферменты вырабатываются в виде неактивных предше­ственников-проферментов, а затем в нужный момент активируются за счет частичного протеолиза. Частичный протеолиз - отщепление части молекулы, которое приводит к изменению третичной структуры белка и формированию активного центра фермента.

Некоторые ферменты-олигомеры могут изменять свою активность за счет ассоциации - диссоциации субъединиц, входящих в их со­став.

Ферменты – это особый вид протеинов, которым природой отведена роль катализаторов разных химических процессов.

Этот термин постоянно на слуху, правда, далеко не все понимают, что такое фермент или энзим, какие функции выполняет это вещество, а также чем отличаются ферменты от энзимов и отличаются ли вообще. Все это сейчас и узнаем.

Без этих веществ ни люди, ни животные не смогли бы переваривать пищу. А впервые к применению ферментов в быту человечество прибегло более 5 тысяч лет тому назад, когда наши предки научились хранить молоко в «посуде» из желудков животных. В таких условиях под воздействием сычужного фермента молоко превращалось в сыр. И это только один из примеров работы энзима в качестве катализатора, ускоряющего биологические процессы. Сегодня ферменты незаменимы в промышленности, они важны для производства сахара, маргаринов, йогуртов, пива, кожи, текстиля, спирта и даже бетона. В моющих средствах и стиральных порошках также присутствуют эти полезные вещества – помогают выводить пятна при низких температурах.

История открытия

Энзим в переводе из греческого означает «закваска». А открытию этого вещества человечество обязано голландцу Яну Баптисту Ван-Гельмонту, жившему в XVI веке. В свое время он весьма заинтересовался спиртовым брожением и в ходе исследования нашел неизвестное вещество, ускоряющее этот процесс. Голландец назвал его fermentum, что в переводе означает «брожение». Затем, почти тремя веками позже, француз Луи Пастер, также наблюдая за процессами брожения, пришел к выводу, что ферменты – не что иное, как вещества живой клетки. А через некоторое время немец Эдуард Бухнер добыл фермент из дрожжей и определил, что это вещество не является живим организмом. Он также дал ему свое название – «зимаза». Еще несколькими годами позже другой немец Вилли Кюне предложил все белковые катализаторы разделить на две группы: ферменты и энзимы. Причем вторым термином он предложил называть «закваску», действия которой распространяются вне живых организмов. И лишь 1897 год положил конец всем научным спорам: оба термины (энзим и фермент) решено использовать как абсолютные синонимы.

Структура: цепь из тысяч аминокислот

Все ферменты являются белками, но не все белки – ферменты. Как и другие протеины, энзимы состоят из . И что интересно, на создание каждого фермента уходит от ста до миллиона аминокислот, нанизанных, словно жемчуг на нить. Но эта нить не бывает ровной – обычно изогнута в сотни раз. Таким образом, создается трехмерная уникальная для каждого фермента структура. Меж тем, молекула энзима – сравнительно крупное образование, и лишь небольшая часть его структуры, так называемый активный центр, участвует в биохимических реакциях.

Каждая аминокислота соединена с другой определенным типом химической связи, а каждый фермент имеет свою уникальную последовательность аминокислот. Для создания большинства из них используются примерно 20 видов аминовеществ. Даже незначительные изменения последовательности аминокислот могут кардинально менять внешний вид и «таланты» фермента.

Биохимические свойства

Хотя при участии ферментов в природе происходит огромное количество реакций, но все они могут быть разгруппированы на 6 категорий. Соответственно, каждая из этих шести реакций протекает под влиянием определенного типа ферментов.

Реакции при участии энзимов:

1. Окисление и восстановление.

Ферменты, участвующие в этих реакциях, называются оксидоредуктазами. В качестве примера можно вспомнить как, алкогольдегидрогеназы преобразуют первичные спирты в альдегид.

1. Реакция переноса группы.

Ферменты, благодаря которым происходят эти реакции, называются трансферазами. Они обладают умением перемещать функциональные группы от одной молекулы к другой. Так происходит, например, когда аланинаминотрансферазы перемещают альфа-аминогруппы между аланином и аспартатом. Также трансферазы перемещают фосфатные группы между АТФ и другими соединениями, а с остатков глюкозы создают дисахариды.

1. Гидролиз.

Гидролазы, участвующие в реакции, умеют разрывать одинарные связи, добавляя элементы воды.

1. Создание или удаление двойной связи.

Этот вид реакций негидролитическим путем происходит при участии лиазы.

1. Изомеризация функциональных групп.

Во многих химических реакциях положение функциональной группы изменяется в пределах молекулы, но сама молекула состоит из того же количества и типов атомов, что были до начала реакции. Иными словами, субстрат и продукт реакции являются изомерами. Такого типа трансформации возможны под влиянием ферментов изомеразы.

1. Образование одинарной связи с устранением элемента воды.

Гидролазы разрушают связь, добавляя в молекулу элементы воды. Лиазы осуществляют обратную реакцию, удаляя водную часть из функциональных групп. Таким образом, создают простую связь.

Как работают в организме

Ферменты ускоряют практически все химические реакции, происходящие в клетках. Они имеют жизненноважное значение для человека, облегчают пищеварение и ускоряют метаболизм.

Некоторые из этих веществ помогают разрушать слишком большие молекулы на более мелкие «куски», которые организм сможет переварить. Другие наоборот связывают мелкие молекулы. Но ферменты, говоря научным языком, обладают высокой селективностью. Это значит, что каждое из этих веществ способно ускорять только определенную реакцию. Молекулы, с которыми «работают» ферменты, называются субстратами. Субстраты в свою очередь создают связь с частью фермента, именуемой активным центром.

Существуют два принципа, объясняющие специфику взаимодействия ферментов и субстратов. В так называемой модели «ключ-замок» активный центр фермента занимает в субстрате место строго определенной конфигурации. Согласно другой модели, оба участника реакции, активный центр и субстрат, меняют свои формы, чтобы соединиться.

По какому бы принципу ни происходило взаимодействие результат всегда одинаковый – реакция под воздействием энзима протекает во много раз быстрее. Вследствие такого взаимодействия «рождаются» новые молекулы, которые потом отделяются от фермента. А вещество-катализатор продолжает выполнять свою работу, но уже при участии других частиц.

Гипер- и гипоактивность

Бывают случаи, когда энзимы выполняют свои функции с неправильной интенсивностью. Чрезмерная активность вызывает чрезмерное формирование продукта реакции и дефицит субстрата. В результате – ухудшение самочувствия и серьезные болезни. Причиной гиперактивности энзима может быть как генетическое нарушение, так и избыток витаминов или , используемых в реакции.

Гипоактивность ферментов может даже стать причиной смерти, когда, например, энзимы не выводят из организма токсины либо возникает дефицит АТФ. Причиной такого состояния также могут быть мутированные гены или, наоборот, гиповитаминоз и дефицит других питательных веществ. Кроме того, пониженная температура тела аналогично замедляет функционирование энзимов.

Катализатор и не только

Сегодня можно часто услышать о пользе ферментов. Но что такое эти вещества, от которых зависит работоспособность нашего организма?

Энзимы – это биологические молекулы, жизненный цикл которых не определяется рамками от рождения и смерти. Они просто работают в организме до тех пор, пока не растворятся. Как правило, это происходит под воздействием других ферментов.

В процессе биохимической реакции они не становятся частью конечного продукта. Когда реакция завершена, фермент покидает субстрат. После этого вещество готово снова приступить к работе, но уже на другой молекуле. И так продолжается столько, сколько необходимо организму.

Уникальность ферментов в том, что каждый из них выполняет только одну, ему отведенную функцию. Биологическая реакция происходит только тогда, когда фермент находит правильный для него субстрат. Это взаимодействие можно сравнить с принципом работы ключа и замка – только правильно подобранные элементы смогут «сработаться». Еще одна особенность: они могут работать при низких температурах и умеренном рН, а в роли катализаторов являются более стабильными, чем любые другие химические вещества.

Ферменты в качестве катализаторов ускоряют процессы метаболизма и другие реакции.

Как правило, эти процессы состоят из определенных этапов, каждый из которых требует работы определенного энзима. Без этого цикл преобразования или ускорения не сможет завершиться.

Пожалуй, из всех функций ферментов наиболее известна – роль катализатора. Это значит, что энзимы комбинируют химические реагенты таким образом, чтоб снизить энергетические затраты, необходимые для более быстрого формирования продукта. Без этих веществ химические реакции протекали бы в сотни раз медленнее. Но на этом способности энзимов не исчерпываются. Все живые организмы содержат энергию, необходимую им для продолжения жизни. Аденозинтрифосфат, или АТФ, это своего рода заряженная батарейка, которая снабжает клетки энергией. Но функционирование АТФ невозможно без ферментов. И главный энзим, производящий АТФ, – синтаза. Для каждой молекулы глюкозы, которая трансформируется в энергию, синтаза производит около 32-34 молекул АТФ.

Помимо этого, энзимы (липаза, амилаза, протеаза) активно применяются в медицине. В частности, служат компонентом ферментативных препаратов, таких как «Фестал», «Мезим», «Панзинорм», «Панкреатин», применяемых для лечения несварения желудка. Но некоторые энзимы способны также влиять на кровеносную систему (растворяют тромбы), ускорять заживление гнойных ран. И даже в противораковой терапии также прибегают к помощи ферментов.

Факторы, определяющие активность энзимов

Поскольку энзим способен ускорять реакции во много раз, его активность определяется так называемым числом оборотов. Этот термин обозначает количество молекул субстрата (реагирующего вещества), которую способна трансформировать 1 молекула фермента за 1 минуту. Однако существует ряд факторов, определяющих скорость реакции:

1. Концентрация субстрата.

Увеличение концентрации субстрата ведет к ускорению реакции. Чем больше молекул действующего вещества, тем быстрее протекает реакция, поскольку задействовано больше активных центров. Однако ускорения возможно только до тех пор, пока не задействуются все молекулы фермента. После этого, даже повышение концентрации субстрата не приведет к ускорению реакции.

1. Температура.

Обычно повышение температуры ведет к ускорению реакций. Это правило работает для большинства ферментативных реакций, но только до тех пор, пока температура не поднимется выше 40 градусов по Цельсию. После этой отметки скорость реакции, наоборот, начинает резко снижаться. Если температура опустится ниже критической отметки, скорость ферментативных реакций повысится снова. Если температура продолжает расти, ковалентные связи рушатся, а каталическая активность фермента теряется навсегда.

1. Кислотность.

На скорость ферментативных реакций также влияет показатель рН. Для каждого фермента существует свой оптимальный уровень кислотности, при котором реакция проходит наиболее адекватно. Изменение уровня рН сказывается на активности фермента, а значит, и скорости реакции. Если изменения слишком велики, субстрат теряет способность связываться с активным ядром, а энзим больше не может катализировать реакцию. С восстановлением необходимого уровня рН, активность фермента также восстанавливается.

Ферменты, присутствующие в человеческом организме, можно разделить на 2 группы:

• метаболические;
• пищеварительные.

Метаболические «работают» над нейтрализацией токсических веществ, а также способствуют выработке энергии и белков. Ну и, конечно, ускоряют биохимические процессы в организме.

За что отвечают пищеварительные – понятно с названия. Но и здесь срабатывает принцип селективности: определенный тип ферментов влияет только на один вид пищи. Поэтому для улучшения пищеварения можно прибегнуть к маленькой хитрости. Если организм плохо переваривает что-то из еды, значит надо дополнить рацион продуктом, содержащим фермент, который способен расщепить трудно перевариваемую пищу.

Пищевые ферменты – катализаторы, которые расщепляют продукты питания до состояния, в котором организм способен поглощать из них полезные вещества. Пищеварительные энзимы бывают нескольких типов. В человеческом организме разные виды ферментов содержатся на разных участках пищеварительного тракта.

Ротовая полость

На этом этапе на пищу воздействует альфа-амилаза. Она расщепляет углеводы, крахмалы и глюкозу, которые содержатся в картофеле, фруктах, овощах и других продуктах питания.

Желудок

Здесь пепсин расщепляет белки до состояния пептидов, а желатиназа – желатин и коллаген, содержащиеся в мясе.

Поджелудочная железа

На этом этапе «работают»:

• трипсин – отвечает за расщепление белков;
• альфа-химотрипсин – помогает усвоению протеинов;
• эластазы – расщепляют некоторые виды белков;
• нуклеазы – помогают расщеплять нуклеиновые кислоты;
• стеапсин – способствует усвоению жирной пищи;
• амилаза – отвечает за усвоение крахмалов;
• липаза – расщепляет жиры (липиды), содержащиеся в молочных продуктах, орехах, маслах и мясе.

Тонкая кишка

Над пищевыми частицами «колдуют»:

• пептидазы – расщепляют пептидные соединения к уровню аминокислот;
• сахараза – помогает усваивать сложные сахара и крахмалы;
• мальтаза – расщепляет дисахариды к состоянию моносахаридов (солодовый сахар);
• лактаза – расщепляет лактозу (глюкозу, содержащуюся в молочных продуктах);
• липаза – способствует усвоению триглицеридов, жирных кислот;
• эрепсин – воздействует на протеины;
• изомальтаза – «работает» с мальтозой и изомальтозой.

Толстый кишечник

Здесь функции ферментов выполняют:

• кишечная палочка – отвечает за переваривание лактозы;
• лактобактерии – влияют на лактозу и некоторые другие углеводы.

Кроме названных энзимов, существуют еще:

• диастаза – переваривает растительный крахмал;
• инвертаза – расщепляет сахарозу (столовый сахар);
• глюкоамилаза – превращает крахмал в глюкозу;
• альфа-галактозидаза – способствует перевариванию бобов, семян, соевых продуктов, корневых овощей и листовых;
• бромелайн – фермент, полученный из , способствует расщеплению разных видов белков, эффективен при разных уровнях кислотности среды, обладает противовоспалительными свойствами;
• папаин – фермент, выделенный из сырой папайи, способствует расщеплению мелких и крупных протеинов, эффективен в широком диапазоне субстратов и кислотности.
• целлюлаза – расщепляет целлюлозу, растительные волокна (в человеческом организме не обнаружена);
• эндопротеаза – расщепляет пептидные связи;
• экстракт бычьей желчи – энзим животного происхождения, стимулирует моторику кишечника;
и других минералов;
• ксиланаза – расщепляет глюкозу из зерновых.

Катализаторы в продуктах

Ферменты имеют решающее значение для здоровья, поскольку помогают организму расщеплять пищевые компоненты до состояния, пригодного для использования питательных веществ. Кишечник и поджелудочная железа производят широкий спектр ферментов. Но кроме этого, многие их полезных веществ, способствующих пищеварению, содержатся также и в некоторых продуктах.

Ферментированные продукты являются практически идеальным источником полезных бактерий, необходимых для правильного пищеварения. И в то время, когда аптечные пробиотики «работают» только в верхнем отделе пищеварительной системы и часто не добираются до кишечника, эффект от ферментативных продуктов ощущается во всем желудочно-кишечном тракте.

Например, абрикосы содержат в себе смесь полезных энзимов, в том числе инвертазу, которая отвечает за расщепление глюкозы и способствует быстрому высвобождению энергии.

Натуральным источником липазы (способствует более быстрому перевариванию липидов) может послужить авокадо. В организме это вещество производит поджелудочная железа. Но дабы облегчить жизнь этому органу, можно побаловать себя, например, салатом с авокадо – вкусно и полезно.

Кроме того, что банан, пожалуй, самый известный источник калия, он также поставляет в организм амилазу и мальтазу. Амилаза содержится также в хлебе, картофеле, крупах. Мальтаза способствует расщеплению мальтозы, так называемого солодового сахара, который в обилии представлен в пиве и кукурузном сиропе.

Другой экзотический фрукт – ананас содержит в себе целый набор энзимов, в том числе и бромелайн. А он, согласно некоторым исследованиям, еще и обладает противораковыми и противовоспалительными свойствами.

Экстремофилы и промышленность

Экстремофилы – это вещества, способны сохранять жизнедеятельность в экстремальных условиях.

Живые организмы, а также ферменты, позволяющие им функционировать, были найдены в гейзерах, где температура близка к точке кипения, и глубоко во льдах, а также в условиях крайней солености (Долина Смерти в США). Кроме того, ученые находили энзимы, для которых уровень рН, как оказалось, также не принципиальное требование для эффективной работы. Исследователи с особым интересом изучают ферменты-экстремофилы, как вещества, которые могут быть широко использованы в промышленности. Хотя и сегодня энзимы уже нашли свое применение в индустрии как биологически и экологически чистые вещества. К применению энзимов прибегают в пищевой промышленности, косметологии, производстве бытовой химии.

Более того, «услуги» ферментов в таких случаях обходятся дешевле, чем синтетических аналогов. Кроме того, натуральные вещества являются биоразлагаемыми, что делает их использование безопасным для экологии. В природе существуют микроорганизмы, способные расщепить ферменты на отдельные аминокислоты, которые затем становятся компонентами новой биологической цепочки. Но это, как говорится, уже совсем другая история.

Глава IV .3.

Ферменты

Обменвеществ в организме можно определить как совокупность всех химических превращений, которым подвергаются соединения, поступающие извне. Эти превращения включают все известные виды химических реакций: межмолекулярный перенос функциональных групп, гидролитическое и негидролитическое расщепления химических связей, внутримолекулярная перестройка, новообразование химических связей и окислительно - восстановительные реакции. Такие реакции протекают в организме с чрезвычайно большой скоростью только в присутствии катализаторов. Все биологические катализаторы представляют собой вещества белковой природы и носят названия ферменты (далее Ф) или энзимы (Е).

Ферменты не являются компонентами реакций, а лишь ускоряют достижение равновесия увеличивая скорость как прямого, так и обратного превращения. Ускорение реакции происходит за счет снижении энергии активации – того энергетического барьера, который отделяет одно состояние системы (исходное химическое соединение) от другого (продукт реакции).

Ферменты ускоряют самые различные реакции в организме. Так достаточно простая с точки зрения традиционной химии реакция отщепления воды от угольной кислоты с образованием СО 2 требует участия фермента, т.к. без него она протекает слишком медленно для регулирования рН крови. Благодаря каталитическому действию ферментов в организме становится возможным протекание таких реакций, которые без катализатора шли бы в сотни и тысячи раз медленнее.

Свойства ферментов

1. Влияние на скорость химической реакции: ферменты увеличивают скорость химической реакции, но сами при этом не расходуются.

Скорость реакции – это изменение концентрации компонентов реакции в единицу времени. Если она идет в прямом направлении, то пропорциональна концентрации реагирующих веществ, если в обратном – то пропорциональна концентрации продуктов реакции. Отношение скоростей прямой и обратной реакций называется константой равновесия. Ферменты не могут изменять величины константы равновесия, но состояние равновесия в присутствии ферментов наступает быстрее.

2. Специфичность действия ферментов. В клетках организма протекает 2-3 тыс. реакций, каждая из которые катализирутся определенным ферментом. Специфичность действия фермента – это способность ускорять протекание одной определенной реакции, не влияя на скорость остальных, даже очень похожих.

Различают:

Абсолютную – когда Ф катализирует только одну определенную реакцию (аргиназа – расщепление аргинина)

Относительную (групповую спец) – Ф катализирует определенный класс реакций (напр. гидролитическое расщепление) или реакции при участии определенного класса веществ.

Специфичность ферментов обусловлена их уникальной аминокислотной последовательностью, от которойзависит конформация активного центра, взаимодействующего с компонентами реакции.

Вещество, химическое превращение которого катализируется ферментом носит название субстрат ( S ) .

3. Активность ферментов – способность в разной степени ускорять скорость реакции. Активность выражают в:

1) Международных единицах активности – (МЕ) количество фермента, катализирующего превращение 1 мкМ субстрата за 1 мин.

2)Каталах (кат) – количество катализатора (фермента), способное превращать 1 моль субстрата за 1 с.

3) Удельной активности – число единиц активности (любых из вышеперечисленных) в исследуемом образце к общей массе белка в этом образце.

4) Реже используют молярную активность – количество молекул субстрата превращенных одной молекулой фермента за минуту.

Активность зависит в первую очередь от температуры . Наибольшую активность тот или иной фермент проявляет при оптимальной температуре. Для Ф живого организма это значение находится в пределах +37,0 - +39,0 ° С, в зависимости от вида животного. При понижении температуры, замедляется броуновское движение, уменьшается скорость диффузии и, следовательно, замедляется процесс образования комплекса между ферментом и компонентами реакции (субстратами). В случае повышения температуры выше +40 - +50 ° С молекула фермента, которая является белком, подвергается процессу денатурации. При этом скорость химической реакции заметно падает (рис. 4.3.1.).

Активность ферментовзависит также от рН среды . Для большинства из них существует определенное оптимальное значение рН, при котором их активность максимальна. Поскольку в клетке содержатся сотни ферментов и для каждого из них существуют свои пределы опт рН, то изменение рН это один из важных факторов регуляции ферментативной активности. Так, в результате одной химреакции при участии определенного фермента рН опт которого лежит в перделах 7.0 – 7.2 образуется продукт, который является кислотой. При этом значение рН смещается в область 5,5 – 6.0. Активность фермента резко снижается, скорость образования продуктазамедляется, но при этом активизируется другой фермент, для которого эти значения рН оптимальны и продукт первой реакции подвергается дальнейшему химическому превращению. (Еще пример про пепсин и трипсин).

Химическая природа ферментов. Строение фермента. Активный и аллостерический центры

Все ферменты это белки с молекулярной массой от 15 000 до нескольких млн Да. По химическому строению различают простые ферменты (состоят только из АК) и сложные ферменты (имеют небелковую часть или простетическую группу). Белковая часть носит название – апофермент, а небелковая, если она связана ковалентно с апоферментом, то называется кофермент, а если связь нековалентная (ионная, водородная) – кофактор . Функции простетической группы следующие: участие в акте катализа, осуществление контакта между ферментом и субстратом, стабилизация молекулы фермента в пространстве.

В роли кофактора обычно выступают неорганические вещества- ионы цинка, меди, калия, магния, кальция, железа, молибдена.

Коферменты можно рассматривать как составную часть молекулы фермента. Это органические вещества, среди которых различают: нуклеотиды (АТФ , УМФ , и пр), витамины или их производные (ТДФ – из тиамина (В 1 ), ФМН – из рибофлавина (В 2 ), коэнзим А – из пантотеновой кислоты (В 3 ), НАД и пр) и тетрапиррольные коферменты – гемы.

В процессе катализа реакции в контакт с субстратом вступает не вся молекула фермента, а определенный ее участок, который называется активным центром . Эта зона молекулы не состоит из последовательности аминокислот, а формируется при скручивании белковой молекулы в третичную структуру. Отдельные участки аминокислот сближаются между собой, образуя определенную конфигурацию активного центра. Важная особенность строения активного центра - его поверхность комплементарна поверхности субстрата, т.е. остатки АК этой зоны фермента способны вступать в химическое взаимодействие с определенными группами субстрата. Можно представить, что активный центр фермента совпадает со структурой субстрата как ключ и замок.

В активном центре различают две зоны: центр связывания , ответственный за присоединение субстрата, и каталитический центр , отвечающий за химическое превращение субстрата. В состав каталитического центра большинства ферментов входят такие АК, как Сер, Цис, Гис, Тир, Лиз. Сложные ферменты в каталитическом центре имеют кофактор или кофермент.

Помимо активного центра ряд ферментов снабжен регуляторным (аллостерическим) центром. С этой зоной фермента взаимодействуют вещества, влияющие на его каталитическую активность.

Механизм действия ферментов

Акт катализа складывается из трех последовательных этапов.

1. Образование фермент-субстратного комплекса при взаимодействии через активный центр.

2. Связывание субстрата происходит в нескольких точках активного центра, что приводит к изменению структуры субстрата, его деформации за счет изменения энергии связей в молекуле. Это вторая стадия и называется она активацией субстрата. При этом происходит определенная химическая модификация субстрата и превращение его в новый продукт или продукты.

3. В результате такого превращения новое вещество (продукт) утрачивает способность удерживаться в активном центре фермента и фермент-субстратный, вернее уже фермент-продуктный комплекс диссоциирует (распадается).

Виды каталитических реакций:

А+Е = АЕ = БЕ = Е + Б

А+Б +Е = АЕ+Б = АБЕ = АБ + Е

АБ+Е = АБЕ = А+Б+Е,где Е - энзим, А и Б - субстраты, либо продукты реакции.

Ферментативные эффекторы - вещества, изменяющие скорость ферментативного катализа и регулирующие за счет этого метаболизм. Среди них различают ингибиторы - замедляющие скорость реакции и активаторы - ускоряющие ферментативную реакцию.

В зависимости от механизма торможения реакции различают конкурентные и неконкурентные ингибиторы. Строение молекулы конкурентного ингибитора сходно со структурой субстрата и совпадает с поверхностью активного центра как ключ с замком (или почти совпадает). Степень этого сходства может даже быть выше чем с субстратом.

Если А+Е = АЕ = БЕ = Е + Б, тоИ+Е = ИЕ ¹

Концентрация способного к катализу фермента при этом снижается и скорость образование продуктов реакции резко падает (рис. 4.3.2.).

В качестве конкурентных ингибиторов выступает большое число химических веществ эндогенного и экзогенного происхождения (т.е. образующихся в организме и поступающих извне – ксенобиотики, соответственно). Эндогенные вещества являются регуляторами метаболизма и называются антиметаболитами. Многие из них используют при лечении онкологических и микробных заболеваний, тк. они ингибируют ключевые метаболичекие реакции микроорганизмов (сульфаниламиды) и опухолевых клеток. Но при избытке субстрата и малой концентрации конкурентного ингибитора его действие отменяется.

Второй вид ингибиторов - неконкурентные. Они взаимодействую с ферментом вне активного центра и избыток субстрата не влияет на их ингибирующую способность, как в случае с конкурентными ингибиторами. Эти ингибиторы взаимодействуют или с определенными группами фермента (тяжелые металлы связываются с тиоловыми группами Цис) или чаще всего регуляторным центром, что снижает связывающую способность активного центра. Собственно процесс ингибирования - это полное или частичное подавление активности фермента при сохранении его первичной и пространственной структуры.

Различают также обратимое и необратимое ингибирование. Необратимые ингибиторы инактивируют фермент, образуя с его АК или другими компонентами структуры химическую связь. Обычно это ковалентная связь с одним из участков активного центра. Такой комплекс практически недиссоциирует в физиологических условиях. В другом случае ингибитор нарушает конформационную структуру молекулы фермента - вызывает его денатурацию.

Действие обратимых ингибиторов может быть снято при переизбытке субстрата или под действием веществ, изменяющих химическую структуру ингибитора. Конкурентные и неконкурентные ингибиторы относятся в большинстве случаев к обратимым.

Помимо ингибиторов известны еще активаторы ферментативного катализа. Они:

1) защищают молекулу фермента от инактивирующих воздействий,

2) образуют с субстратом комплекс, который более активно связывается с активным центром Ф,

3) взаимодействуя с ферментом, имеющим четвертичную структуру, разъединяют его субъединицы и тем самым открывают доступ субстрату к активному центру.

Распределение ферментов в организме

Ферменты, участвующие в синтезе белков, нуклеиновых кислот и ферменты энергетического обмена присутствуют во всех клетках организма. Но клетки, которые выполняют специальные функции содержат и специальные ферменты. Так клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе содержат ферменты, катализирующие синтез гормонов инсулина и глюкагона. Ферменты, свойственные только клеткам определенных органов называют органоспецифическими: аргиназа и урокиназа - печень, кислая фосфатаза - простата. По изменению концентрации таких ферментов в крови судят о наличии патологий в данных органах.

В клетке отдельные ферменты распределены по всей цитоплазме, другие встроены в мембраны митохондрий и эндоплазматического ретикулума, такие ферменты образуют компартменты, в которых происходят определенные, тесно связанные между собой этапы метаболизма.

Многие ферменты образуются в клетках и секретируются в анатомические полости в неактивном состоянии - это проферменты. Часто в виде проферментов образуются протеолитические ферменты (расщепляющие белки). Затем под воздействием рН или других ферментов и субстратов происходит их химическая модификация и активный центр становится доступным для субстратов.

Существуют также изоферменты - ферменты, отличающиеся по молекулярной структуре, но выполняющие одинаковую функцию.

Номенклатура и классификация ферментов

Название фермента формируется из следующих частей:

1. название субстрата с которым он взаимодействует

2. характер катализируемой реакции

3. наименование класса ферментов (но это необязательно)

4. суффикс -аза-

пируват - декарбоксил - аза,сукцинат - дегидроген - аза

Посколькууже известно порядка 3 тыс. ферментов их необходимо классифицировать. В настоящее время принята международная классификация ферментов, в основу которой положен тип катализируемой реакции. Выделяют 6 классов, которые в свою очередь делятся на ряд подклассов (в данной книге представлены только выборочно):

1. Оксидоредуктазы. Катализируют окислительно-восстановительные реакции. Делятся на 17 подклассов. Все ферменты содержат небелковую часть в виде гема или производных витаминов В 2 , В 5 . Субстрат, подвергающийся окислению выступает как донор водорода.

1.1. Дегидрогеназы отщепляют от одного субстрата водород и переносят на другие субстраты. Коферменты НАД, НАДФ, ФАД, ФМН. Они акцептируют на себе отщепленный ферментом водород превращаясь при этом в восстановленную форму (НАДН, НАДФН, ФАДН) и переносят к другому фермент-субстратному комплексу, где его и отдают.

1.2. Оксидазы - катализирует перенос водорода на кислород с образованием воды или Н 2 О 2 . Ф. Цитохромокисдаза дыхательной цепи.

RH + NAD H + O 2 = ROH + NAD + H 2 O

1.3. Монооксидазы - цитохром Р450 . По своему строению одновременно гемо- и флавопротеид. Он гидроксилирует липофильные ксенобиотики (по вышеописанному механизму).

1.4. Пероксидазы и каталазы - катализируют разложение перекисиводорода, которая образуется в ходе метаболических реакций.

1.5. Оксигеназы - катализируют реакции присоединения кислорода к субстрату.

2. Трансферазы - катализируют перенос различных радикалов от молекулы донора к молекуле акцептору.

Аа + Е + В = Еа + А + В = Е + Ва + А

2.1. Метилтрансферазы (СН 3 -).

2.2.Карбоксил- и карбамоилтрансферазы.

2.2. Ацилтрансферазы – Кофермент А (перенос ацильной группы - R -С=О).

Пример: синтез нейромедиатора ацетилхолина (см.главу "Обмен белков").

2.3. Гексозилтрансферазы- катализируют перенос гликозильных остатков.

Пример: отщепление молекулы глюкозы от гликогена под действием фосфорилазы .

2.4. Аминотрансферазы - перенос аминогрупп

R 1- CO - R 2 + R 1 - CH - NH 3 - R 2 = R 1 - CH - NH 3 - R 2 + R 1- CO - R 2

Играют важную роль в превращении АК. Общим коферментом являнтся пиридоксальфосфат.

Пример: аланинаминотрансфераза (АлАТ): пируват + глутамат = аланин + альфа-кетоглутарат (см.главу "Обмен белков").

2.5. Фосфотрансфереза (киназа) - катализируют перенос остатка фосфорной кислоты. В большинстве случает донором фосфата является АТФ. В процессе расщепления глюкозы в основном принимают участие ферменты этого класса.

Пример: Гексо (глюко)киназа .

3. Гидролазы - катализируют реакции гидролиза, т.е. расщепление веществ с присоединением по месту разрыва связи воды. К этому классу относятся преимущественно пищеварительные ферменты, они однокомпонентные (не содержат небелковой части)

R1-R2 +H 2 O = R1H + R2OH

3.1. Эстеразы - расщепляют эфирные связи. Это большой подкласс ферментов, катализирующих гидролиз тиоловых эфиров, фосфоэфиров.
Пример: NH 2 ).

Пример: аргиназа (цикл мочевины).

4.Лиазы - катализируют реакции расщепления молекул без присоединения воды. Эти ферменты имеют небелковую часть в виде тиаминпирофосфата (В 1) и пиридоксальфосфата (В 6).

4.1. Лиазы связи С-С. Их обычно называют декарбоксилазами.

Пример: пируватдекарбоксилаза .

5.Изомеразы - катализируют реакции изомеризации.

Пример: фосфопентозоизомераза, пентозофосфатизомераза (ферменты неокислительной ветви пентозофосфатного пути).

6.Лигазы катализируют реакции синтеза более сложных веществ из простых. Такие реакции идут с затратой энергии АТФ. К названию таких ферментов прибавляют "синтетаза".

ЛИТЕРАТУРА К ГЛАВЕ IV .3.

1. Бышевский А. Ш., Терсенов О. А. Биохимия для врача // Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994, 384 с.;

2. Кнорре Д. Г., Мызина С. Д. Биологическая химия. – М.: Высш. шк. 1998, 479 с.;

3. Филиппович Ю. Б., Егорова Т. А., Севастьянова Г. А. Практикум по общей биохимии // М.: Просвящение, 1982, 311с.;

4. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки // М.: Мир, 1974, 956 с.;

5. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии // Ростов-на Дону: Феникс, 1999, 540 с.

Введение

1.Типы ферментов

2.Структура ферментов

Механизм действия ферментов

Библиографический список

Введение

Ферменты - наиболее важный класс белковых веществ, универсальный по своей биологической функции. Ферменты представляют собой специфические и высокоэффективные катализаторы химических реакций, протекающих в живой клетке. Изучение ферментов, их строения, свойств и механизма биологического действия составляет один из главных разделов биохимии и биоорганической химии. К настоящему времени охарактеризовано несколько тысяч ферментов, свыше тысячи из них получены в индивидуальном состоянии. Для многих сотен белков-ферментов выяснена аминокислотная последовательность, а самые известные из них расшифрованы с помощью рентгеноструктурного анализа до уровня полной пространственной структуры. Изучение любой проблемы в области познания механизмов жизнедеятельности обязательно связано с исследованием соответствующих ферментных систем. Кроме того, ферменты широко используются как мощные инструменты при выяснении строения биополимеров и при генно-инженерных разработках. Они находят широкое практическое применение в медицине и пищевой промышленности.

Ферментативные процессы известны человеку с глубокой древности. В частности, брожение широко использовалось греками для получения вина (открытие этого способа приписывалось богу Бахусу). Народы многих стран издавна владели искусством приготовления хлеба, сыра, уксуса на основе переработки растительного и животного сырья. Однако современный этап в развитии энзимологии относится к началу прошлого века. В 1814 г. член Петербургской Академии наук К. Кирхгоф установил, что крахмал превращается в сахар под действием некоторых веществ, находящихся в прорастающих зернах ячменя. Дальнейший шаг вперед в этом направлении был сделан французскими химиками А. Пайеном и Ж. Пирсо, которые в 1833 г. показали, что термолабильный фактор, получаемый из солодового экстракта путем осаждения спиртом, обладает способностью гидролизовать крахмал; они назвали его диастазой.

Вскоре разгорелся спор о природе брожения, в котором участвовали крупнейшие представители естествознания того времени. В частности, Л. Пастер придерживался мнения, что брожение вызывается живыми микроорганизмами и, следовательно, связано исключительно с их жизнедеятельностью. С другой стороны, Ю. Либих и К. Бернар отстаивали химическую природу брожения, считая, что оно связано с особыми веществами, подобными диастазе (амилазе). Й. Берцелиус в 1837 г. показал, что ферменты - это катализаторы, поставляемые живыми клетками. Именно тогда появились термины «фермент» (от лат. fermentatio- брожение) и «энзим» (от греч. - в дрожжах). Спор был окончательно разрешен лишь в 1897 г., когда немецкие ученые братья Ганс и Эдвард Бухнеры показали, что дрожжевой бесклеточный сок (полученный при растирании дрожжей с инфузорной землей) способен сбраживать сахар с образованием спирта и СО2. Стало ясным, что дрожжевой сок содержит сложную смесь ферментов (названную зимазой) и эти ферменты способны функционровать как внутри, так и вне клеток. По словам одного из историков, появление пузырьков углекислого газа в опыте Бухнеров означало рождение современных биохимии и энзимологии.

Попытки выделить ферменты в индивидуальном состоянии предпринимали многие исследователи, среди которых следует упомянуть А. Я. Данилевского, Р. Вильштеттера и др. Белковая природа ферментов была однозначно доказана в 1926 г. американским биохимиком Дж. Самнером, выделившим в кристаллическом виде фермент уреазу из семян канавалии. В 1930 г. Дж. Нортроп получил кристаллический пепсин, а затем трипсин и химотрипсин. С этого периода стало общепринятым утверждение, что все ферменты являются белками.

В конце XIX в. на базе достижений в области исследования структуры органических соединений биологического происхождения появилась возможность изучения специфичности ферментов. В это время Э. Фишером было выдвинуто знаменитое положение о необходимости стерического соответствия между ферментом и субстратом; по его образному выражению, «субстрат подходит к ферменту, как ключ к замку». В начале XX века были заложены основы исследования кинетики действия ферментов.

Ферменты имеют различные молекулярные массы - от 10 000 до 1000 000 и выше. Они могут быть построены из одной полипепидной цепи, нескольких полипептидных цепей или представлять собой сложные (иногда полиферментные) комплексы. В состав фермента входят и небелковые компоненты, получившие название коферентов (кофакторов), - ионы металлов, небольшие органические молекулы типа витаминов и т.д.

Ферменты являются высокоэффективными катализаторами: они способны увеличивать скорости реакции в миллионы и миллиарды раз. Так, например, уреаза (при рН 8,0, 20 0С) ускоряет гидролиз мочевины примерно в 1014 раз.

Ферменты являются высокоспецифичными катализаторами. Они проявляют специфичность в отношении типа катализируемой химической реакции, причем образования побочных продуктов не происходит. Кроме того, они обладают выраженной субстратной специфичностью и, как правило, высокой стереоспецифичностью.

1. Типы ферментов

Классификация ферментов. Ранее при наименовании ферментов за основу брали название субстрата с добавлением суффикса «аза»; так появились, в частности, протеиназы, липазы, карбогидразы. По исходному принципу обозначали ферменты, катализирующие окислительные реакции (дегидрогеназы). Некоторые ферменты получили специальные названия - трипсин, пепсин и др. В настоящее время принята классификация, в которой ферменты сгруппированы в 6 классов в соответствии с типом катализируемых реакций:

Оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные реакции).

Трансферазы (реакции переноса функциональных групп) .

Гидролазы (реакции гидролиза).

Лиазы (реакции отщепления групп негидролитическим путем) .

Изомеразы (реакции изомеризации).

Лигазы (реакции синтеза за счет энергии АТР).

В пределах классов ферменты группируются в подклассы и подклассы в соответствии с особенностями катализируемых реакций; на этой основе составлена кодовая нумерация (шифры) ферментов и их систематические названия. Шифр фермента состоит из четырех разделенных точками чисел: первое число означает класс фермента, второе и третье числа - подкласс и подподкласс соответственно, а четвертое число - порядковый номер фермента в его подподклассе. Например, кислая фосфатаза имеет шифр 3.1.3.2; это означает, что она относится к классу гидролаз (3.1.3.2), подклассу этих ферментов, действующих на сложноэфирные связи (3.1.3.2), к подподклассу ферментов, гидролизующих моноэфиры фосфорной кислоты (3.1.3.2), а порядковый номер фермента в данном подподклассе - 2 (3.1.3.2).

Ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но выделенные из разных видов живых организмов, различаются между собой. В номенклатуре же они имеют общее название и один кодовый номер. Различные формы того или иного фермента нередко встречаются и у одного биологического вида. Для наименования группы ферментов, катализирующих одну и ту же реакцию и находящихся в организмах одного вида, рекомендуется термин множественные формы фермента. Для тех ферментов одной группы, которые имеют генетически обусловленные различия в первичной структуре, используют термин «изоферменты».

Оксидоредукта?зы - отдельный класс ферментов, катализирующих лежащие в основе биологического окисления реакции, сопровождающиеся переносом электронов с одной молекулы (восстановителя - акцептора протонов или донора электронов) на другую (окислитель - донора протонов или акцептора электронов).

Реакции, катализируемые оксидоредуктазами, в общем виде выглядят так:

B ? A + B?

Где A - восстановитель (донор электронов), а B - окислитель (акцептор электронов)

В биохимических превращениях окислительно-восстановительные реакции иногда выглядят сложнее. Вот, например, одна из реакций гликолиза:

н + глицеральдегид-3-фосфат + НАД+ ? НАД · H + H+ + 1,3-дифосфоглицерат

Здесь в качестве окислителя выступает НАД+, а глицеральдегид-3-фосфат является восстановителем.

Систематические названия ферментов класса образуются по схеме «донор: акцептор + оксидоредуктаза». Однако широко используются и другие схемы именования. Когда возможно, ферменты называют в виде «донор + дегидрогеназа», например глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, для второй реакции выше. Иногда название записывается как «акцептор + редуктаза», например НАД+-редуктаза. В частном случае, когда окислителем является кислород, название может быть в виде «донор + оксидаза».

Согласно международной классификации и номенклатуре ферментов оксидоредуктазы относятся к 1 классу, в пределах которого выделяют двадцать два подкласса:

КФ 1.1 включает ферменты, взаимодействующие с CH-OH группой доноров;

КФ 1.2 включает ферменты, взаимодействующие с альдегидной или оксо-группой доноров;

КФ 1.3 включает ферменты, взаимодействующие с CH-CH группой доноров;

КФ 1.4 включает ферменты, взаимодействующие с CH-NH2 группой доноров;

КФ 1.5 включает ферменты, взаимодействующие с CH-NH группой доноров;

КФ 1.6 включает ферменты, взаимодействующие с НАД · H или НАДФ · H;

КФ 1.7 включает ферменты, взаимодействующие с другими азотосодержащими соединениями в качестве доноров;

КФ 1.8 включает ферменты, взаимодействующие с сероусодержащей группой доноров;

КФ 1.9 включает ферменты, взаимодействующие с гемовой группой доноров;

КФ 1.10 включает ферменты, взаимодействующие с дифенолами и родственными соединениями в качестве доноров;

КФ 1.11 включает ферменты, взаимодействующие с пероксидом в качестве акцептора (пероксидазы);

КФ 1.12 включает ферменты, взаимодействующие с водородом в качестве донора;

КФ 1.13 включает ферменты, взаимодействующие с одиночными донорами со встраиванием молекулярного кислорода (оксигеназы);

КФ 1.14 включает ферменты, взаимодействующие с парными донорами со встраиванием молекулярного кислорода;

КФ 1.15 включает ферменты, взаимодействующие с супероксид-радикалами в качестве акцепторов;

КФ 1.16 включает ферменты, окисляющие ионы металлов;

КФ 1.17 включает ферменты, взаимодействующие с CH или CH2 группами;

КФ 1.18 включает ферменты, взаимодействующие с железосерными белками в качестве доноров;

КФ 1.19 включает ферменты, взаимодействующие с восстановленным флаводоксином в качестве донора;

КФ 1.20 включает ферменты, взаимодействующие с фосфором или мышьяком в качестве донора;

КФ 1.21 включает ферменты, взаимодействующие с молекулами вида X-H и Y-H с образованием связи X-Y;

КФ 1.97 включает другие оксидоредуктазы.

Трансфера?зы - отдельный класс ферментов, катализирующих перенос функциональных групп и молекулярных остатков от одной молекулы к другой. Широко распространены в растительных и животных организмах, участвуют в превращениях углеводов, липидов, нуклеиновых и аминокислот.

Реакции, катализируемые трансферазами, в общем случае выглядят так:

X + B ? A + B-X.

Молекула A в здесь выступает в качестве донора группы атомов (X), а молекула B является акцептором группы. Часто в качестве донора в подобных реакциях переноса выступает один из коферментов. Многие из катализируемых трансферазами реакций являются обратимыми.

Систематические названия ферментов класса образуются по схеме:

«донор:акцептор + группа + трансфераза».

Или же используются чуть более общие названия, когда в название фермента включается имя либо донора, либо акцептора группы:

«донор + группа + трансфераза» или «акцептор + группа + трансфераза».

Например, аспартатаминотрансфераза катализирует перенос аминной группы с молекулы аспарагиновой кислоты, катехол-О-метилтрансфераза осуществляет перенос метильной группы S-аденозилметионина на бензольное кольцо различных катехоламинов, а гистон-ацетилтрансфераза переносит ацетильную группу с ацетил-кофермента А на гистон в процессе активации транскрипции.

Кроме того ферменты 7 подгруппы трансфераз, переносящие остаток фосфорной кислоты, используя в качестве донора фосфатной группы АТФ, часто называют также киназами; аминотрансферазы (6 подгруппа) часто называют трансаминазами.

Согласно международной классификации и номенклатуре ферментов трансферазы относятся ко 2 классу, в пределах которого выделяют девять подклассов:

КФ 2.1 включает ферменты, переносящие одноуглеродные группы;

КФ 2.2 - ферменты, переносящие альдегидные и кетонные группы;

КФ 2.3 - переносящие ацильные остатки (ацилтрансферазы);

КФ 2.4 - переносящие остатки сахаров (гликозилтрансферазы);

КФ 2.5 - переносящие алкильные и арильные группы за исключеним метильного остатка;

КФ 2.6 - переносящие группы атомов, содержащие азот;

КФ 2.7 - переносящие фосфор-содержащие остатки;

КФ 2.8 - переносящие группы, содержащие серу;

КФ 2.9 - переносящие группы, содержащие селен.

Гидролазы - это класс ферментов, катализирующий гидролиз ковалентной связи. Общий вид реакции, катализируемой гидролазой выглядит следующим образом:

B + H2O ? A-OH + B-H

Систематическое название гидролаз включает название расщепляемого субстрата с последующим добавлением гидролаза. Однако, как правило в тривиальном названии слово гидролаза опускается и остаётся только суффикс «-аза».

КФ 3.1 сложноэфирная связьэстеразы: нуклеаза, фосфодиэстераза, липаза, фосфатаза

КФ 3.2 сахарагликозидазы: амилаза, гиалуронидаза, лизоцим и др.

КФ 3.3 простая эфирная связь

КФ 3.4 пептидная связьпротеазы: трипсин, химотрипсин, эластаза, тромбин, ренин и др.

КФ 3.5 непептидная углерод-азотная связь

КФ 3.6 кислотный ангидридкислотный ангидрид-гидролаза (хеликаза, ГТФаза)

КФ 3.7 углерод-углеродная связь (C-C)

КФ 3.8 галогенная связь

КФ 3.9 азотно-фосфорная связь (P-N)

КФ 3.10 азотно-серная связь (S-N)

КФ 3.11 углеродно-фосфорная связь (C-P)

КФ 3.12 дисульфидная связь (S-S)

КФ 3.13 серо-углеродная связь (C-S)

Лиа?зы (синтазы) - отдельный класс ферментов, катализирующих реакции негидролитического и неокислительного разрыва различных химических связей (C-C, C-O, C-N, C-S и других) субстрата, обратимые реакции образования и разрыва двойных связей, сопровождающиеся отщеплением или присоединением групп атомов по её месту, а также образованием циклических структур.

В общем виде названия ферментов образуются по схеме «субстрат + лиаза». Однако чаще в названии учитывают подкласс фермента. Лиазы отличаются от других ферментов тем, что в катализируемых реакциях в одном направлении участвуют два субстрата, а в обратной реакции только один. В названии фермента присутствуют слова "декарбоксилаза" и "альдолаза" или "лиаза" (пируват-декарбоксилаза, оксалат-декарбоксилаза, оксалоацетат-декарбоксилаза, треонин-альдолаза, фенилсерин-альдолаза, изоцитрат-лиаза, аланин-лиаза, АТФ-цитрат-лиаза и др.), а для ферментов, катализирующих реакции отщепления воды от субстрата - "дегидратаза" (карбонат-дегидратаза, цитрат-дегидратаза, серин-дегидратаза и др.). В тех случаях, когда обнаружена только обратная реакция, или это направление в реакциях более существенно, в названии ферментов пристутствует слово "синтаза" (малат-синтаза, 2-изопропилмалат-синтаза, цитрат-синтаза, гидроксиметилглутарил-CoA-синтаза и др.).

Примеры: гистидиндекарбоксилаза, фумаратгидратаза.

По международной классификации и номенклатуре ферментов лиазы принадлежат к 4 классу, в пределах которого выделяют семь подклассов:

КФ 4.1 включает ферменты, которые расщепляют углерод-углеродные связи, например, декарбоксилазы (карбокси-лиазы);

КФ 4.2 - ферменты, расщепляющие углерод-кислородные связи, например, дегидратазы;

КФ 4.3 - ферменты, расщепляющие углерод-азотные связи (амидин-лиазы);

КФ 4.4 - ферменты, расщепляющие углерод-серные связи;

КФ 4.5 - включает ферменты, расщепляющие связи углерод - галоген, например, ДДТ-дегидрохлориназа;

КФ 4.6 - ферменты, расщепляющие фосфор-кислородные связи, например, аденилатциклаза;

КФ 4.99 - включает другие лиазы

Изомеразы - ферменты, катализирующие структурные превращения изомеров (рацемизация или эпимеризация). Изомеразы катализируют реакции, подобные следующей:? B, где B является изомером A.

В названии фермента присутствует слово "рацемаза" (аланин-рацемаза, метионин-рацемаза, гидроксипролин-рацемаза, лактат-рацемаза и др.), "эпимераза" (альдоза-1-эпимераза, рибулозофосфат-4-эпимераза, УДФ-глюкуронат-4-эпимераза и др.), "изомераза" (рибозофосфат-изомераза, ксилозоизомераза, глюкозаминфосфат-изомераза, эноил-СоА изомераза и др.), "мутаза" (фосфоглицерат-мутаза, метиласпартат-мутаза, фосфоглюкомутаза и др.).

Изомеразы имеют собственную классификацию, КФ 5 и имеют следующие подклассы:

КФ 5.1 включает ферменты, катализирующие рацемизацию (рацемазы) и эпимеризацию (эпимеразы)

КФ 5.2 включает ферменты, катализирущие геометрическую изомеризацию (цис-транс изомеразы)

КФ 5.3 включает внутримолекулярные оксидоредуктазы

КФ 5.4 включает трансферазы (мутазы)

КФ 5.5 включает внутримолекулярные лиазы

КФ 5.99 включает другие изомеразы, в том числе, топоизомеразы

Лигазы (синтетазы). К классу лигаз относят ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата). Систематическое название их составляют по форме «X: Y лигаза», где X и Y обозначают исходные вещества. В качестве примера можно назвать L-глутамат: аммиак лигазу (рекомендуемое сокращенное название «глутаминсинтета-за»), при участии которой из глутаминовой кислоты и аммиака в присутствии АТФ синтезируется глутамин.

Лигазы подразделяют по типу связи, образование которой они катализируют:O-лигазаS-лигазаN-лигазаC-лигаза

Структура ферментов

В природе существуют как простые, так и сложные ферменты. Первые целиком представлены полипептидными цепями и при гидролизе распадаются исключительно на аминокислоты. Такими ферментами (простые белки) являются гидролитические ферменты, в частности пепсин, трипсин, папаин, уреаза, лизоцим, рибонуклеаза, фосфатаза и др. Большинство природных ферментов относится к классу сложных белков, содержащих, помимо полипептидных цепей, какой-либо небелковый компонент (кофактор), присутствие которого является абсолютно необходимым для каталитической активности. Кофакторы могут иметь различную химическую природу и различаться по прочности связи с полипептидной цепью. Если константа диссоциации сложного фермента настолько мала, что в растворе все полипептидные цепи оказываются связанными со своими кофакторами и не разделяются при выделении и очистке, то такой фермент получает название холофермента (холоэнзим), а кофактор - простетической группы, рассматривающейся как интегральная часть молекулы фермента. Полипептидную часть фермента принято называть апоферментом.

В литературе до сих пор употребляются и другие наименования компонентов сложных ферментов, в частности «фермент-протеид», «белковый компонент» (апофермент), «кофермент» (коэнзим) и «простетическая группа». Под коферментом часто подразумевают дополнительную группу, легко отделяемую от апофермента при диссоциации. Предполагают, что простетическая группа может быть связана с белком ковалентными и нековалентными связями. Так, в молекуле ацетилкоэнзим-А-карбоксилазы кофактор биотин ковалентно связан с апоферментом посредством амидной связи. С другой стороны, химические связи между кофакторами и пептидными цепями могут быть относительно слабыми (например, водородные связи, электростатические взаимодействия и др.). В таких случаях при выделении ферментов наблюдается полная диссоциация обеих частей, и изолированый белковый компонент оказывается лишенным ферментативной активности, пока не будет добавлен извне недостающий кофактор. Именно к подобным изолированным низкомолекулярным органическим веществам применим термин «кофермент», типичными представителями которых являются витамины В1, В2, В6, РР, содержащие коферменты. Известно также, что и простетические группы, и коферменты активно включаются в химические реакции, выполняя функции промежутоных переносчиков электронов, атомов водорода или различных функциональных групп (например, аминных, ацетильных, карбоксильных). В подобных случаях кофермент рассматривают в качестве второго субстрата, или косубстрата.

Роль кофермента (Ко) в качестве переносчика, например, атомов водорода может быть представлена в виде схемы, где SH - субстрат, КоЕ - холофермент, А - акцептор протона:

Субстрат подвергается окислению, отдавая электроны и протоны, а КоЕ - восстановлению, принимая электроны и протоны. В следующей полуреакции восстановленный КоЕН может отдавать электроны и протоны на какой-либо другой промежуточный переносчик электронов и протонов или на конечный акцептор.

Коэнзим, кофактор, простетическая группа - двусмысленный биохимический жаргон. До сих пор продолжается терминологический спор, поскольку часто определения «коэнзим», «кофактор» и «простетическая группа» рассматриваются через призму их роли в реакциях энзиматического (ферментативного) катализа. Следует, однако, считаться с тем неоспоримым фактом, что во многих случаях небелковые органические молекулы, как и ионы металлов, абсолютно необходимы белковому компоненту при выполнении определенной биологической функции, не имеющей отношения к биокатализу. Несомненно, имеют значение также тип и характер связи небелкового компонента с молекулой белка. Поэтому очевидно, что кофактором может служить любой фактор, абсолютно необходимый для выполнения белком его каталитической или любой другой биологической роли. С другой стороны, коферментом может быть любой небелковый фактор, который непосредственно вовлечен в реакцию энзиматического катализа. Кофактор, который непосредственно не участвует в акте катализа, не является коэнзимом. В то же время простетическую группу (ковалентно связанный небелковый компонент, необходимый для определенной функции) можно назвать коферментом, если она непосредственно участвует в энзиматической реакции. Простетическая группа, которая не вовлечена в акт катализа, но функционально является существенным как для фермента, так и для некаталитического белка, может быть названа кофактором. И наконец, кофактор и кофермент, непрочно связанные (или слабо связанные) с ферментом или белком, тем не менее, не классифицируются в качестве простетических групп.

Многие двухвалентные металлы (Mg2+, Мn2+, Са2+) также выполняют роль кофакторов, хотя они не относятся ни к коферментам, ни к простетическим группам. Известны примеры, когда ионы металлов прочно связаны с белковой молекулой, выполняя функции простетической группы. В частности, очищенный фермент, катализирующий окисление аскорбиновой кислоты (витамин С) в дезоксиаскорбиновую кислоту, содержит 8 атомов меди на одну молекулу; все они настолько прочно связаны с белковой молекулой, что даже не обмениваются с ионообменными смолами и не отделяются методом диализа. Более того, с помощью метода электронного парамагнитного резонанса показано участие ионов меди в промежуточном переносе электронов. Интересно отметить, что свободные ионы меди также наделены каталитической активностью при окислении аскорбиновой кислоты, однако эта активность повышается во многие тысячи раз, если ионы меди соединяются с апофер-ментом в единый комплекс - холофермент.

Получены доказательства кофакторной функции в ферментативных реакциях и ряда других биологически активных соединений, не относящихся к витаминам: HS-глутатиона, АТФ, липоевой кислоты, производных нуклеозидов (уридинфосфат, цитидинфосфат, фосфоаденозинфосфосульфат), порфиринсодержащих веществ и др. Сюда же могут быть отнесены тРНК, которые в составе ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз принимают активное участие в транспорте аминокислот в рибосоме, где осуществляется синтез белка.

Следует отметить одну отличительную особенность двухкомпонентных ферментов: ни кофактор отдельно (включая большинство коферментов), ни сам по себе апофермент каталитической активностью не наделены, и только их объединение в одно целое, протекающее не хаотично, а в соответствии с программой их структурной организации, обеспечивает быстрое протекание химической реакции.

Активный центр ферментов.

При изучении механизма химической реакции, катализируемой ферментами, исследователя всегда интересует не только определение промежуточных и конечных продуктов и выяснение отдельных стадий реакции, но и природа тех функциональных групп в молекуле фермента, которые обеспечивают специфичность действия фермента на данный субстрат (субстраты) и высокую каталитическую активность. Речь идет, следовательно, о точном знании геометрии и третичной структуры фермента, а также химической природы того участка (участков) молекулы фермента, который обеспечивает высокую скорость каталитической реакции. Участвующие в ферментативных реакциях молекулы субстратов часто имеют небольшие размеры по сравнению с молекулами ферментов, поэтому было высказано предположение, что при образовании фермент-субстратных комплексов в непосредственный контакт с молекулой субстрата, очевидно, вступает ограниченная часть аминокислот пептидной цепи. Отсюда возникло представление об активном центре фермента. Под активным центром подразумевают уникальную комбинацию аминокислотных остатков в молекуле фермента, обеспечивающую непосредственное связывание ее с молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа. Установлено, что у сложных ферментов в состав активного центра входят также простетические группы.

В активном центре условно различают так называемый каталитический центр, непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с субстратом, и связывающий центр, или контактную («якорную») площадку, которая обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование его комплекса с ферментом. В свою очередь молекула субстрата также содержит функционально различные участки: например, субстраты эстераз или протеиназ - одну специфическую связь (или группу атомов), подвергающуюся атаке со стороны фермента, и один или несколько участков, избирательно связываемых ферментом.

Получены экспериментальные доказательства наличия в активном центре химотрипсина двух остатков гистидина и остатка серина, схематически представленных в трехмерной структурной модели предшественника этого фермента. Выявление химической природы и вероятной топографии групп активного центра - проблема первостепенной важности. Она сводится к определению природы аминокислот, их последовательности и взаиморасположения в активном центре. Для идентификации так называемых существенных аминокислотных остатков используют специфические ингибиторы ферментов (часто это субстратподобные вещества или аналоги коферментов), методы «мягкого» (ограниченного) гидролиза в сочетании с химической модификацией, включающей избирательное окисление, связывание, замещение остатков аминокислот и др.

При помощи методов ингибиторного анализа были предприняты попытки установить закономерности состава и структуры активных центров у ферментов, относящихся к разным группам. В частности, при использовании диизопропилфторфосфата (ДФФ), принадлежащего к так называемым нервным ядам, наблюдается полное выключение активного центра холинэстеразы - фермента, катализирующего гидролиз ацетилхолина на холин и уксусную кислоту. Оказалось, что этот ингибитор имеет близкое структурное сходство с ацетилхолином и подобно ему взаимодействует с ОН-группой остатка серина в активном центре. Вызывая фосфорилирование серина в активном центре ряда других ферментов, ДФФ также инактивирует их действие:

Показано, что ДФФ избирательно фосфорилирует в каждом чувствительном к нему ферменте только один остаток серина, наделенный функциональной активностью. Учитывая этот механизм действия ДФФ, сделаны попытки определения природы аминокислот в окружении «каталитического» остатка серина у ряда ферментов.

Помимо активного центра, в молекуле фермента может присутствовать также аллостерический центр (или центры) (от греч. allos - другой, иной и steros - пространственный, структурный), представляющий собой участок молекулы фермента, с которым связываются определенные, обычно низкомолекулярные, вещества (эффекторы, или модификаторы), молекулы которых отличаются по структуре от субстратов. Присоединение эффектора к аллостерическому центру изменяет третичную и часто также четвертичную структуру молекулы фермента и соответственно конфигурацию активного центра, вызывая снижение или повышение энзиматической активности. Ферменты, активность каталитического центра которых подвергается изменению под влиянием аллостерических эффекторов, связывающихся с аллостерическим центром, получили название аллостерических ферментов.

Отличительной особенностью ряда аллостерических ферментов является наличие в молекуле олигомерного фермента нескольких активных центров и нескольких аллостерических регуляторных центров, пространственно удаленных друг от друга. В аллостерическом ферменте каждый из двух симметрично построенных протомеров содержит один активный центр, связывающий субстрат S, и один аллостерический центр, связывающий эффектор М2, т.е. 2 центра в одной молекуле фермента. Получены доказательства, что для субстрата аллостерические ферменты, помимо активного центра, содержат и так называемые эффекторные центры; при связывании с эффекторным центром субстрат не подвергается каталитическому превращению, однако он влияет на каталитическую эффективность активного центра. Подобные взаимодействия между центрами, связывающими лиганды одного типа, принято называть гомотропными взаимодействиями, а взаимодействия между центрами, связывающими лиганды разных типов, - гетеротропными взаимодействиями.

Таким образом, в энзиматическом катализе, как и в реакции связывания субстрата, участвует не ограниченная и небольшая часть фермента, как предполагалось ранее, а значительно большая часть молекулы белка-фермента. Этими обстоятельствами, вероятнее всего, можно объяснить большие размеры и объемность трехмерной структуры молекулы фермента; эти же обстоятельства следует учитывать в программах создания искусственных низкомолекулярных аналогов ферментов (синзимов), обладающих свойствами нативных ферментов.

Механизм действия ферментов

фермент биологический катализ трансаминирование

Раскрытие с помощью рентгеноструктурного анализа пространственного строения ряда ферментов явилось надежной основой для построения рациональных схем механизма их действия.

Установление механизма действия ферментов имеет ключевое значение для раскрытия структурно-функциональных взаимосвязей во множестве биологически активных систем.

Лизоцим обнаружен в различных тканях животных и растений, он находится, в частности, в слезной жидкости и яичном белке. Лизоцим функционирует как антибактериальный агент, катализируя гидролиз клеточных стенок ряда бактерий. Этот полисахарид образован чередующимися остатками N-ацетилмурановой кислоты (NAM), соединенными ?-1,4-гликозидной связью (полисахаридные цепи сшиты короткими пептидными фрагментами).

Бактериальный полисахарид является весьма сложным нерастворимым соединением, в связи с чем в качестве субстратов лизоцима часто используют хорошо гидролизуемые олигосахариды, образованные остатками NAG.

Лизоцим белка куриных яиц образован одной полипептидной цепью, содержащей 129 аминокислотных остатков; его молекулярная масса составляет 14 600. Высокая стабильность фермента обеспечивается наличием четырех дисульфидных мостиков.

Информация об активном центре и типе каталитического процесса была получена Д. Филипсом в 1965г. на основе рентгеноструктурных исследований лизоцима и его комплексов с ингибиторами. Молекула лизоцима имеет форму эллипсоида с осями 4,5*3*3 нм; между двумя половинами молекулы находится «щель», в которой происходит связывание олигосахаридов. Стенки щели образованы в основном боковыми цепями неполярных аминокислот, обеспечивающими связывание неполярных молекул субстрата, и включают также боковые цепи полярных аминокислот, которые способны образовывать водородные связи с ациламинными и гидроксильными группами субстрата. Размер щели позволяет разместиться молекуле олигосахарида, содержащей 6 остатков моносахаридов. Методом рентгеноструктурного анализа установить характер связывания субстрата, например гексасахарида NAG6, не удается. В то же время комплексы фермента с ингибитором трисахаридом NAG3 стабильны и хорошо изучены. NAG3 связывается в щели на поверхности фермента, образуя водородные связи и ван-дер-ваальсовы контакты; при этом он заполняет только половину щели, в которой могут связаться еще три моносахаридных остатка. Невосстанавливающий конец (сахар А) оказывается у начала щели, а восстанавливающий конец (сахар С) - в центральной ее части; остатки сахаров А, В и С имеют конформацию кресла. Построение модели фермент-субстратного комплекса было основано на предположении о том, что при связывании субстрата NAG6 реализуются те же взаимодействия, что и при связывании NAG3. На модели фермента внутри щели были размещены три остатка сахара (обозначаемые как остатки D, E и F); каждый последующий сахар присоединялся таким образом, чтобы его конформация была такой же (насколько это возможно), как и у первых трех сахаров. В составе модельного комплекса все остатки сахаров реализуют эффективные нековалентные взаимодействия с боковыми и пептидными группами аминокислотных остатков, образующих щель.

При идентефикации каталитических групп естественно было сосредоточить внимание на тех из них, которые в фермент-субстратном комплексе находятся около расщепляемой гликозидной связи и могут служить донорами или акцепторами протонов. Оказалось, что по одну сторону от расщепляемой связи, на расстоянии? 0,3 нм (от кислорода гликозидной связи), находится карбоксильная группа Glu-35, а по другую (на таком же расстоянии) карбоксильная группа Asp-52, окружение их сильно различается. Glu-35 окружена гидрофобными остатками; можно предполагать, что в оптимуме рН фермента эта группа находится в неионизированном состоянии. Окружение Asp-52 выражено полярное; ее карбоксильная группа участвует в качестве акцептора водорода в сложной сети водородных связей и функционирует, вероятно, в ионизированном состоянии.

Предложена следующая схема каталитического процесса при гидролизе олигосахарида. Неионизированная карбоксильная группа Glu-35 выступает в качестве донора протона, поставляя его гликозидному атому кислорода между атомом С(1) сахара D и атомом С(4) сахара Е (стадия общего кислотного катализа); это приводит к разрыву гликозидной связи. В результате остаток сахара D переходит в состояние карбкатиона с положительно заряженным атомом углерода С(1) и принимает конформацию полукресла. Отрицательный заряд карбоксилатной группы Asp-52 стабилизирует карбкатион. Остаток NAG2 (сахара E+F) диффундирует из области активного центра. Затем в реакцию вступает молекула воды; ее протон переходит к Glu-35, а ОН- -группа к атому С(1) остатка D (стадия основного катализа). Остаток NAG4 (сахара А+В+С+D) уходит из области активного центра, и фермент возвращается в исходное состояние.

Рибонуклеаза (РНКаза) поджелудочной железы быка гидролизует межнуклеотидные связи в РНК около пиримилиновых звеньев, которые при этом остаются этерифицированы по 3-положению. Фермент наряду с другими нуклеазами широко используется при анализе структуры РНК.

РНКаза образована одной полипептидной цепью, содержащей 124 аминокислотных остатка, а ее молекулярная масса равна 13 680; в молекуле имеется четыре дисульфидные связи. РНКаза является первым ферментом, для которого была установлена первичная структура.

На основании результатов исследования ренатурации рибонуклеазы К. Афинсен впервые четко сформулировал представление о том, что пространственное строение белка определяется его первичной структурой.

В 1958 г. Ф. Ричардс показал, что в определенных условиях субтилизин расщепляет в РНКазе пептидную связь Ala-20 - Ser-21. Образующиеся фрагменты были названии S-пептидом (остатки 1-20) и S-белком (остатки 21-124); за счет нековалентных взаимодействий фрагменты образуют комплекс, названный РНКазой S. Этот комплекс обладает почти полной каталитической активностью нативного фермента; в изолированном виде S-пептид и S-белок неактивны. Далее было установлено, что синтетический пептид, идентичный по последовательности фрагменту S-пептида, содержащий остатки с 1 по 13, восстанавливает активность S-белка, однако более короткий пептид, содержащий остатки с 1 по 11, такой способностью не обладает. Полученные данные позволили сделать заключение о том, что соответствующие остатки His-12 или Met-13 (или оба этих остатка) входят в активный центр фермента.

При исследовании влияния рН на активность РНКазы была выяснена важная роль функциональных групп белка с рК 5,2 и 6,8; это позволяло предполагать участие в каталитическом процессе остатков гистидина.

При карбоксилировании РНКазы иодацетатом при рН 5,5, т.е. в условиях, при которых преимущественно происходит модификация остатков гистидина, наблудалась полная утрата активности; модифицированный фермент содержит 1 моль карбоксиметильных групп на 1 моль белка. В результате образуются две монокарбоксиметиленовые формы фермента. В одной форме карбоксиметилированным является остаток His-12, а в другой - His-119. Преимущественно модифицировался His-119.

Эти данные позволили предположить, что His-12 и His-119 находятся в активном центре и что модификация одного из них препятствует модификации другого.

В результате рентгеноструктурных исследований было выяснено пространственное строение РНКазы S и комплекса РНКазы S с ингибиторами. Молекула имеет форму почки, активный центр локализован в углублении, где находятся остатки His-12, His-119 и Lys-41.

Гидролиз происходит в результате сопряженного действия остатков His-12 и His-119, осуществляющих кислотно-основной катализ. На приведенной схеме указаны стадии каталитического процесса:

1.Субстрат находится в активном центре; His-12, His-119 и Lys-41 расположены около отрицательно заряженного фосфата.

2.В результате действия His-12 как основания, акцептирующего протон от 2-ОН-группы рибозы, и His-119 как кислоты, отдающей протон атому кислорода фосфата, образуется сначала промежуточный комплекс, а затем 2,3-циклический фосфат.

.На место ушедшего продукта поступает вода, отдающая протон His-119, а ОН- - фосфату, одновременно протон от His-12 переходит к кислородному атому рибозы, образуется второй продукт, а фермент возвращается в исходное состояние.

Химотрипсин секретируется в форме профермента - химотрипсиногена поджелудочной железой позвоночных животных; активация профермента происходит в двенадцатиперстной кишке под действием трипсина. Физиологическая функция химотрипсина - гидролих белков и полипептидов. Химотрипсин атакует преимущественно пептидные связи, образованные карбоксильными остатками тирозина, триптофана, ценилаланина и метионани. Он эффективно гидролизует также сложные эфиры соответствующих аминокислот. Молекулярная масса химотрипсина равна 25 000, молекула содержит 241 аминокислотный остаток. Химотрипсин образован тремя полипептидными цепями, которые связаны дисульфидными мостиками.

Функциональные группы активного центра химотрипсина идентифицированы с помощью необратимых ингибиторов. Остаток Ser-195 был модифицирован диизопропилфторфосфатом и фенилметилсульфофторидом, а остаток His-122 - N-тозил-L-фенилаланин-хлорметилкетоном. Двухстадийность процесса химотрипсинового гидролиза была обнаружена при изучении кинетики гидролиза п-нитрофенилацетата.

Характерной чертой рассматриваемого процесса является образование ковалентного интермедиата - ацилфермента. Ацилируемая каталитическая группа была идентефицирована - остаток Ser-195. Механизм катализа, осуществляемого ферментом, был предложен еще до установления пространственной структуры белка, но позднее был уточнен. В частности, исследования с помощью 18Н2О позволили доказать образование ацилфермента при гидролизе пептидов.

Трехмерная структура с разрешением 0,2 нм была установлена методом рентгеноструктурного анализа Д.Блоу. в 1976г. Молекула имеет форму эллипсоида с осями 5,4*4*4 нм. Результаты кристаллографических исследований подтвердили предположения о том, что остатки Ser-195 и His-57 сближены. Гидроксильная группа Ser-195 находится на расстоянии?0,3 нм орт атома азота имидазольного кольца His-57. Наиболее интересным оказалось то обстоятельство, что атом азота в положении 1 кольца находится на расстоянии?0,28 нм от атома кислорода карбоксильной группы боковой цепи Asp-102 и занимает положение, благоприятное для образования водородной связи.

Следует отметить, что химические исследования не могли выявить участия Asp-102 в функционировании активного центра, поскольку этот остаток погружен вглубь молекулы.

В настоящее время считается, что три остатка Asp-102, His-57 и Ser-195 образуют систему переноса заряда, которая играет решающую роль в процессе катализа. Функционирование системы обеспечивает эффективное участие His-57 в катализе в качестве кислотно-основного катализатора и повышает реакционную способность Ser-195 к карбоксильному углероду атакуемой связи.

Ключевым элементом катализа является перенос протона от Ser-195 к His-57. Одновременно происходит атака атомом кислорода серина карбонильного атома углерода субстрата с образованием сначала промежуточного тетраэдрического соединения (1), а затем ацилфермента (2). На следующей стадии происходит деацилирование. Молекула воды поступает в систему переноса заряда, а ион ОН- одновременно атакует карбонильный атом углерода ацильной группы ацилфермента. Как и на стадии ацилирования, образуется промежуточное тетраэдрическое соединение (4). Затем His-57 поставляет протон атому кислорода Ser-195, в результате чего высвобождается ацильный продукт; он диффундирует в раствор, а фермент возвращается в исходное состояние.

Карбоксипептидаза А секретируется в виде профермента поджелудочной железой позвоночных животных. Образование активного фермента происходит в тонком кишечнике при участии химотрипсина. Фермент последовательно отщепляет от пептидной цепи остатки С-концевых аминокислот, т.е. является экзопептидазой.

Карбоксипептидаза А образована одиночной полипептидной цепью, содержащей 307 аминокислотных остатков; молекулярная масса равна 34 470. Аминокислотная последовательность белка была установлена в 1969 г. Р. Бредщоу.

Выяснение механизма действия фермента оказалось возможным только после проведения рентгеноструктурных исследований. Пространственная структура фермента и его комплекса с дипептидом Gly-Tyr (модель субстрата) была установлена У. Липскомбом. Молекула фермента имеет форму эллипсоида с осями 5,0*4,2*3,8 нм; активный центр находится в углублении, переходящем в глубокий неполярный карман. В зоне активного центра локализован ион цинка (его лигандами являются боковые цепи остатков Glu-72, His196, His-69 и молекула воды), а также функциональные группы, участвующие в связывании субстрата и катализе, - остатки Arg-145, Glu-270 и Tyr-248.

При сравнительном анализе структур фермента и его комплекса с Gly-Tyr была получена важная информация о строении фермент-субстратного комплекса. В частности, установлено, что при образовании комплекса гидроксильная группа Tyr-248 перемещается на 1,2 нм по отношению к своему положению в свободном ферменте (т.е. примерно на 1/3 диаметра молекулы).

Согласно схеме каталитического процесса, карбоксилатная группа Glu-270 активирует молекулу воды, находящуюся в сфере реакции, оттягивая от нее протон; образующийся ион ОН- осуществляет нуклеофильную атаку на карбонильный углерод расщепляемой связи. Одновременно гидроксильная группа Tyr-248, находящаяся около атома азота расщепляемой пептидной связи, отдает ему протон. В результате атакуемая пептидная связь расщепляется и образующиеся продукты уходят из зоны активного центра. Приведенная схема иллюстрирует общий основный катализ.

Аспартатаминотрансфераза катализирует обратимую реакцию трансаминирования.

Ферментативная реакция трансаминирования была открыта А.Е. Браунштейном и М.Г. Крицман в 1937г. при изучении ферментного препарата из мышцы голубя. В последующих исследованиях было показано, что реакции трансаминирования широко распространены в живой природе и играют важную роль в сопряжении азотистого и энергетического обмена.

В 1945 г. было установлено, что пиридоксаль-5-фосфат (ПЛФ) является коферментом аминотрансфераз. Молекула ААТ является димером, образованным идентичными субъединицами. В сердечной мышце исследованных позвоночных имеются два изофермента - цитоплазматическая (цААТ0 и митохондриальная (мААТ) аминотрансферазы.

Первичная структура цААТ из сердечной мышцы была установлена в 1972г. Ю.А. Овчинниковым и А.Е. Брайнштейном. Полипептидная цепь белка содержит 412 аминокислотных остатков; молекулярная масса равна 46 000.

Общая теория пиридоксалевого катализа была разработана А.Е. Браунштейном и М.М. Шемякиным в 1952-1953 гг., а несколько позднее - Д.Е. Мецлером и Е.Е. Снеллом. Согласно этой теории, каталитическое действие пиридоксалевых ферментовобусловлено способностью альдегидной группы пиридоксальфосфата образовывать при взаимодействии с аминами, в том числе с аминокислотами, альдимины (шиффовы основания).

В образующейся фосфопиридоксилденаминокислоте имеется система сопряженных двойных связей, по которой происходит смещение электронов от ?-углеродного атома облегчает разрыв связей, образованных этим атомом.

Современные представления о механизме ферментативного трансаминирования, разработанные А.Е. Браунштейном и его сотрудниками, являются развитием рассмотренной выше теории. В исходном состоянии альдегидная группа пиридоксальфосфата образует альдиминную связь с ?-аминогруппой остатка Lys-258 активного центра (I). При связывании аминокислоты образуется комплекс Михаэлиса (II), а затем альдимин между пиридоксальфосфатом и субстратом (III). В результате последующих превращений через промежуточные стадии (IV) и (V) образуется оксокислота (VI). Этим заканчивается первая полуреакция трансаминирования. Повторение этих же стадий в «обратном направлении» с новой оксикислотой составляет вторую полуреакцию, завершающую каталитический цикл трансаминирования.

Миоглобин и гемоглобин

Эти два белка часто называют дыхательными ферментами. Взаимодействие их с субстратом - кислородом выснено детально, прежде всего на основе рентгеноструктурного анализа высокого разрешения. Трехмерная структура миоглобина была определениа Дж. Кендрью в 1961г., а трехмерная структура гемоглобина - М. Перутцем в 1960 г.

Молекула миоглобина имеет компактную форму - 4,5*3,5*2,5 нм, полипептидная цепь образует 8 спирализованных участков, обозначаемых буквами от А до Н. Она специализированным образом уложена вокруг большого плоского железосодержащего кольца гема. Гем - это комплекс порфирина с двухвалентным железом.

Полярные цепи пропионовой кислоты гема находятся на поверхности молекулы, остальная часть гема погружена в глобулу. Связь гема с белком осуществляется за счет координационной связи между атомом железа и атомом гистидина, локализованного в спирали F; это так называемый проксимальный гистидин. В гемовом кармане в составе спирали Е локализован другой важный остаток гистидина - дистальный гистидин; он находится с противоположной стороны от атома железа на большем расстоянии, чем проксимальный гистидин. Область между железом гена и дистальным гистидином в дизоксимиоглобине свободна, и липофильная молекула О2 может связываться с железом гема, занимая шестое координационное положение. Уникальной особенностью миоглобина, а также гемоглобина, является их способность обратимо связывать О2 без окисления гемового Fe2+ в Fe3+. Это оказывается возможным, поскольку в гидрофобном гемовом карман, из которого вытеснена вода, создается среда с низкой диэлектрической проницаемостью.

При связывании О2 с атомом железа последний перемещается примерно на 0,06 нм и оказывается в плоскости порфиринового кольца, т.е. в энергетически более выгодном положении. Предполагают, что это перемещение обусловлено тем, что ион Fe2+ в дезоксимиоглобине находится в высокоспиновом состоянии и радиус его является слишком большим, чтобы он мог разместиться в плоскости порфиринового кольца гема. При связывании же О2 ион Fe2+ переходит в низкомпиновое состояние и его радиус уменьшается; теперь ион Fe2+ может переместиться в плоскость порфиринового кольца.

Гемоглобин - основной компонент эритроцитов крови, осуществляющий доставку кислорода от легких к тканям, а углекислоты - из тканей в легкие. Гемоглобины разных видов отличаются по форме кристаллов, растворимости, сродству к кислороду. Это обусловлено различиями в аминокислотной последовательности белков; гемовый компонент одинаков у гемоглобинов всех видов позвоночных и некоторых беспозвоночных животных.

Гемоглобин человека представляет собой тетрамер, состоящий из четырех субъединиц, двух ?-субъединиц и двух ?-субъединиц, содержащих по 141 и 146 аминокислотных остатков соответственно. Между первичными структурами ?- и ?-субъединиц существует значительная гомология, сходны также и конформация их полипептидных цепей.

Молекула гемоглобинаимеет сферическую форму, диаметр которой равен 5,5 нм. Четыре субъединицы упакованы в форме тетраэдра.

Данные рентгеноструктурного анализа показали, что оксигенирование гемоглобина сопровождается рядом изменений. При низком разрешении установлено, что в этом случае структура становится более компактной (атомы Fe ?-цепей сближаются примерно на 0,6-0,7 нм), субъединицы поворачиваются друг относительно друга и оси второго порядка на 10-15о. Результаты исследования при высоком разрешении свидетельствуют о том, что особенно значительные изменения происходят в области ??-контактов.

К настоящему времени на основе рентгеноструктурных исследований и ряда других методических подходов достигнуты значительные успехи в выяснении механизма действия ферментов с заданными свойствами на основе достижений в области генной инженерии. Это открывает широкие возможности для проверки справедливости современных представлений о механизме действия ферментов и создания фундаментальной теории ферментативного катал.

Библиографический список

1. А. Ленинджер Основы биохимии. - Москва Мир, 1985.

Ю.А. Овчинников. Биоорганическая химия. - Москва Просвещение, 1987.

Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. Биологическая химия. - Москва Медицина, 1990.

Репетиторство

Нужна помощь по изучению какой-либы темы?

Наши специалисты проконсультируют или окажут репетиторские услуги по интересующей вас тематике.
Отправь заявку с указанием темы прямо сейчас, чтобы узнать о возможности получения консультации.